姜利英+岳保磊+梁茂+周鵬磊+肖小楠

摘 要： 針對(duì)核酸適體電流型傳感器信號(hào)弱、噪聲高、測(cè)量難的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種可準(zhǔn)確檢測(cè)三磷酸腺苷（ATP）濃度的核酸適體傳感器檢測(cè)電路。該電路主要包括恒電位電路、I/V轉(zhuǎn)換電路、多級(jí)放大電路、帶通濾波和鎖相放大電路。利用循環(huán)伏安法研究并分析了核酸適體傳感器的輸出電壓與被測(cè)物ATP濃度之間的關(guān)系。測(cè)試結(jié)果表明：電流型核酸適體傳感器檢測(cè)系統(tǒng)具有很高的信噪比、較好的靈敏度和線性度，線性度為0.994 0，能夠滿足現(xiàn)場(chǎng)快速準(zhǔn)確測(cè)試的需求。

關(guān)鍵詞： 核酸適體傳感器； ATP濃度； 微電流檢測(cè)； 鎖定放大； 電路測(cè)試

中圖分類號(hào)： TN98?34； TP216 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1004?373X（2015）14?0120?04

0 引 言

ATP是體內(nèi)組織細(xì)胞一切生命活動(dòng)所需能量的直接來(lái)源，可促使機(jī)體各種細(xì)胞的修復(fù)和再生，增強(qiáng)細(xì)胞代謝活性[1]。細(xì)胞內(nèi)ATP濃度與活細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)：細(xì)胞代謝受損時(shí)，ATP合成下降；細(xì)胞死亡時(shí)，在酶的作用下，ATP迅速水解消失；因此迅速而準(zhǔn)確地測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP濃度在研究細(xì)胞乃至機(jī)體的生理活性和代謝過(guò)程以及臨床診斷方面都有非常重要的意義。

現(xiàn)有ATP檢測(cè)法包括定磷法、熒光素酶法、質(zhì)譜法等，但這些方法所需要的儀器價(jià)格昂貴且只能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求。因此發(fā)展簡(jiǎn)便迅速的ATP檢測(cè)系統(tǒng)意義重大。本文通過(guò)對(duì)低噪聲放大技術(shù)、鎖相放大技術(shù)的研究，設(shè)計(jì)了基于核酸適體傳感器的ATP濃度檢測(cè)電路，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)系統(tǒng)的精確性、便攜式和智能化。測(cè)試結(jié)果表明該系統(tǒng)能快速準(zhǔn)確檢測(cè)出ATP濃度，解決了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的諸多不便。

1 檢測(cè)原理

用于檢測(cè)ATP濃度的核酸適體傳感器是利用微機(jī)電系統(tǒng)（Micro Electro Mechanical Systems，MEMS）加工技術(shù)、薄膜技術(shù)并結(jié)合電化學(xué)沉積技術(shù)制備的基于共面薄膜金電極的高靈敏度傳感器，本傳感器采用三電極體系如圖1所示，即工作電極（Working Electrode，W）、對(duì)電極（Counter Electrode，C）和Ag/AgCl參比電（Reference Electrode，R）。

核酸適體傳感器工作電極表面的適體采用巰基固化的單鏈DNA（ssDNA）或雙鏈DNA（dsDNA）進(jìn)行修飾。由于核酸適體與ATP有高親和力和選擇性，當(dāng)引入ATP后，核酸適體與ATP相結(jié)合，工作電極表面產(chǎn)生負(fù)電荷。當(dāng)在對(duì)電極上施加激勵(lì)電壓，工作電極與對(duì)電極之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)形成電流，該電流大小與ATP濃度有一定的關(guān)系，通過(guò)對(duì)工作電極電流信息進(jìn)行檢測(cè)分析，可知對(duì)應(yīng)的ATP濃度。

圖1 基礎(chǔ)電極的形狀

2 檢測(cè)電路設(shè)計(jì)

檢測(cè)系統(tǒng)主要由激勵(lì)信號(hào)（三角波）、恒電位電路、信號(hào)調(diào)理（I/V轉(zhuǎn)換、多級(jí)放大、帶通濾波）和鎖相放大組成，系統(tǒng)框圖如圖2所示。激勵(lì)信號(hào)電路產(chǎn)生的三角波電壓通過(guò)恒電位電路循環(huán)加在核酸適體傳感器上，I/V轉(zhuǎn)換電路將工作電極產(chǎn)生的電流轉(zhuǎn)換成電壓，再經(jīng)過(guò)多級(jí)放大和帶通濾波電路進(jìn)行信號(hào)調(diào)理，通過(guò)鎖相放大電路去除噪聲，得到ATP濃度與輸出電壓關(guān)系曲線圖。

圖2 檢測(cè)電路的原理框圖

2.1 激勵(lì)信號(hào)產(chǎn)生模塊及恒電位電路

激勵(lì)信號(hào)是由單片機(jī)配合RC低通電路所產(chǎn)生的三角波，并將信號(hào)加到恒電位電路輸入端，如圖3所示。

圖3 恒電位電路

運(yùn)放 OP1與OP2組成恒電位電路，恒電位電路的主要作用是將一個(gè)穩(wěn)定的工作電壓施加到傳感器上，解決電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中工作電位偏移的問題[2]，其工作原理如下：

[Ur=Ua=VinR2R1] （1）

由此可知： 參比電極的電位與電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的電流無(wú)關(guān)，只與輸入的激勵(lì)電壓與電阻有關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)了恒電位功能。

2.2 信號(hào)調(diào)理電路

信號(hào)調(diào)理電路由I/V轉(zhuǎn)換電路、多級(jí)放大電路、帶通濾波電路組成。本電路將核酸適體傳感器得到的電流信號(hào)轉(zhuǎn)換為電壓信號(hào)，經(jīng)放大電路放大后，通過(guò)帶通濾波器保留所需頻帶信號(hào)。

2.2.1 I/V轉(zhuǎn)換和多級(jí)放大電路

傳統(tǒng)的I/V轉(zhuǎn)換電路由運(yùn)算放大器和反饋電阻并聯(lián)組成。受運(yùn)算放大器和反饋電阻的輸入阻抗限制，過(guò)大的反饋電阻會(huì)使阻值的精度降低、穩(wěn)定性變差、噪聲增大。圖4所示為改進(jìn)后的T型I/V轉(zhuǎn)換電路。

圖4 I/V轉(zhuǎn)換電路

核酸適體傳感器在三角波電壓激勵(lì)下工作電極產(chǎn)生電流，大小約為4×10-8A，經(jīng)I/V轉(zhuǎn)換電路轉(zhuǎn)換成mV級(jí)以上電壓。該電路的反饋電阻：

[R=-R2+R4′+R5R11+R2//（R4″+R5）R3+R4′] （2）

式中：R表示電路總反饋電阻；R′表示上半部分電阻；R″表示下半部分電阻。 接到輸出端分壓電阻上，通過(guò)并聯(lián)負(fù)反饋增大反饋電阻，構(gòu)成并聯(lián)負(fù)反饋的各電阻的阻值都不需要太大，就可以得到足夠大的總反饋電阻，從而降低電阻噪聲。

多級(jí)放大電路中第一級(jí)放大電路對(duì)總噪聲的影響最大，系統(tǒng)的總噪聲系數(shù)由第一個(gè)放大電路的噪聲系數(shù)決定[3]。第一級(jí)放大電路所選用的元器件應(yīng)為低噪聲、高精度的器件。放大電路圖如圖5所示，該級(jí)放大電路采用反向輸入方式，輸入電阻R20為10 kΩ，反饋電阻R24為100 kΩ，放大倍數(shù)[n=-R24R20=-10]。其中電容C10的作用是進(jìn)行相位補(bǔ)償，避免運(yùn)放產(chǎn)生自激振蕩。

2.2.2 帶通濾波電路

本設(shè)計(jì)采用通用芯片 UAF42 設(shè)計(jì)中心頻率為10 kHz的帶通濾波器進(jìn)行信號(hào)處理，濾除被測(cè)信號(hào)頻率以外的其他頻率信號(hào)，提高檢測(cè)系統(tǒng)的信噪比。UAF42芯片具有自帶的filter 仿真設(shè)計(jì)軟件和不同品質(zhì)因數(shù)、不同類型的濾波器連接圖[4]。UAF42 設(shè)計(jì)帶通濾波器時(shí)只需外接三個(gè)電阻，電路簡(jiǎn)單且容易實(shí)現(xiàn)。

基于上述優(yōu)點(diǎn)本設(shè)計(jì)采用UAF42 通用芯片設(shè)計(jì)了中心頻率為10 kHz的帶通濾波器，設(shè)計(jì)參數(shù)圖、設(shè)計(jì)電路圖分別如圖6、圖7所示。

圖5 第一級(jí)放大電路

圖6 10 kHz帶通濾波器的設(shè)計(jì)參數(shù)圖

圖7 10 kHz帶通濾波器的設(shè)計(jì)電路圖

2.3 鎖相放大電路

鎖相放大過(guò)程是利用調(diào)制器將待測(cè)微弱直流或緩變信號(hào)變換成高頻交流信號(hào)，對(duì)其放大后再解調(diào)恢復(fù)出原始信號(hào)。該過(guò)程濾除了原信號(hào)中的低頻噪聲（[1f]噪聲），同時(shí)避免了直流放大器的直流漂移偏差。鎖相放大器的基本結(jié)構(gòu)如圖8所示，包括信號(hào)通道、參考通道、相敏檢測(cè)器（PSD）和低通濾波器（LPF）等[5]。

本電路的輸入信號(hào)為10 kHz正弦波與前端低頻信號(hào)調(diào)制后的信號(hào)，參考信號(hào)為10 kHz的正弦信號(hào)。在信號(hào)通道內(nèi)對(duì)調(diào)制信號(hào)進(jìn)行交流放大，再由帶通濾波器濾除其他頻率信號(hào)干擾，同時(shí)對(duì)信號(hào)進(jìn)行放大處理以滿足相敏檢測(cè)的工作電壓，相敏解調(diào)后的信號(hào)再通過(guò)低通濾波器恢復(fù)出待測(cè)低頻信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)頻帶的搬移和消除低頻噪聲。采用相敏解調(diào)芯片AD630搭建的相敏檢測(cè)電路如圖9所示。

圖8 鎖相放大器的基本結(jié)構(gòu)圖

圖9 相敏檢測(cè)電路

輸入信號(hào)[x（t）]為[Vscos（ω0t+θ）]，噪聲信號(hào)[z（t）]為[Vncos（ωnt+α）]，參考信號(hào)[r（t）]為[Vrcosω0t]，經(jīng)過(guò)解調(diào)后的信號(hào)為[up（t）]，有：

[up（t）=x（t）?r（t）=0.5VsVrcos（ω0t+θ）+0.5VsVrcos（ω0t+θ）+ 0.5VnVrcos[（ω0+ωn）t+α]+0.5VnVrcos[（ωn-ω0）t+α]] （3）

式中：右邊的第1項(xiàng)為調(diào)制信號(hào)與參考信號(hào)的差頻項(xiàng)；第2項(xiàng)為調(diào)制信號(hào)與參考信號(hào)的和頻項(xiàng)；第3項(xiàng)為噪聲信號(hào)與參考信號(hào)的和頻項(xiàng)；第4項(xiàng)為噪聲信號(hào)與參考信號(hào)的差頻項(xiàng)。經(jīng)過(guò)低通濾波器后輸出為第1項(xiàng)[0.5VsVrcos（ω0t+θ）]和第4項(xiàng)中[ωn-ω0

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了研究核酸適體傳感器檢測(cè)ATP濃度與輸出電壓的關(guān)系，對(duì)標(biāo)定不同濃度的ATP溶液分別進(jìn)行檢測(cè)，得出對(duì)應(yīng)的輸出電壓值如表1所示。

由表1可知，隨著ATP濃度的不斷增大，輸出電壓值也隨著增大。為了進(jìn)一步研究ATP濃度輸出電壓值進(jìn)行作圖，如圖10所示?？梢钥闯?，核酸適體與ATP結(jié)合后，在ATP濃度為 5～100 nmoL/L時(shí)，輸出電壓與ATP濃度表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)[R2=0.994 0]。

表1 ATP濃度不同時(shí)對(duì)應(yīng)的輸出電壓值

圖10 ATP濃度與輸出電壓關(guān)系曲線

4 結(jié) 語(yǔ)

本文設(shè)計(jì)的核酸適體傳感器檢測(cè)系統(tǒng)具有成本低、精度高、便攜式的特點(diǎn)，電路具有較強(qiáng)的擴(kuò)展能力，通過(guò)調(diào)整濾波器參數(shù)，可實(shí)現(xiàn)更寬頻帶信號(hào)的測(cè)量。同時(shí)，多次進(jìn)行的測(cè)試證明了該核酸適體傳感器檢測(cè)電路性能穩(wěn)定、抗噪能力強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)1×109 A電流檢測(cè)放大，完全能夠滿足ATP濃度檢測(cè)范圍的要求。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉文偉，韓躍式.核酸適體電化學(xué)生物傳感器的研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2010，6（10）：154?156.

[2] 姜利英，張艷，王芬芬，等.基于核酸適體ATP測(cè)試的電化學(xué)測(cè)試系統(tǒng)設(shè)計(jì)[J].儀表技術(shù)與傳感器，2013（11）：47?49.

[3] 張金利，景占榮，梁亮，等.微弱信號(hào)的調(diào)理電路設(shè)計(jì)和噪聲分析[J].電子測(cè)量技術(shù)，2007（11）：40?42.

[4] 鄧勇，劉琪，施文康.通用有源濾波器UAF42的CAD軟件：FILTER42[J].國(guó)外電子器件，2010（11）：18?21.

[5] 高晉占.微弱信號(hào)檢測(cè)[M].北京：清華大學(xué)出版社，2011.

[6] 閆行，朱榮.基于傳感器微弱電流矢量檢測(cè)電路的設(shè)計(jì)[J].自動(dòng)化與儀表，2011（1）：13?16.

[7] 羅金平，田青，周愛玉，等.微生物快速檢測(cè)用生物傳感器基本特性研究[J].微納電子技術(shù)，2007（7）：383?386.

[8] 王蜜霞，劉軍濤，劉儒平，等.基于FPGA的高精度光子計(jì)數(shù)檢測(cè)系統(tǒng)研究[J].傳感器與微系統(tǒng)，2011（2）：20?22.

[9] 閆瑞芳，苗江歡，孫波.信號(hào)抑制型三磷酸腺苷電化學(xué)發(fā)光體傳感器的研究[J].中國(guó)化工貿(mào)易，2011（10）：55?56.

[10] 陳鳴，府偉靈，吳蓉，等.肽核酸壓電基因傳感器新型生物信號(hào)放大系統(tǒng)的研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005（11）：1193?1196.