毛揚帆，李明春，辛梅華

（華僑大學材料科學與工程學院，環(huán)境友好功能材料教育部工程中心，福建 廈門 361021）

自組裝是指由分子之間的非共價相互作用驅動以及分子形狀自發(fā)識別而形成超分子結構[1]。自組裝的形成一般由一種作用力為主或幾種作用力共同作用，其中靜電作用較其他二級作用力更強[2]。殼聚糖及其衍生物常用于具有靜電作用的自組裝中，Wang 等[3]制備了N,N-二甲基-N-十八烷基-賴氨酸改性殼聚糖（OQLCS），分別接枝聚乙二醇單甲醚（mPEG）和葉酸（FA），制得mPEG-OQLCS 和FA-OQLCS，將三者與膽固醇混合利用水化法制得自組裝囊泡，囊泡對鈣黃綠素具有低滲透率，可應用于親水性藥物的包載。Fan 等[4]制備了兩親性的O-羧甲基-N-烷基化殼聚糖，研究了產物與陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴混合體系的自組裝行為，結果表明，混合體系能自發(fā)形成囊泡，靜電作用和疏水作用是囊泡形成的主要驅動力。Shu 等[5]制備了N-(2-羥基)丙基-3-三甲基殼聚糖季銨鹽與硫酸葡聚糖自組裝納米球，以牛血清蛋白為模型藥物，研究了蛋白質藥物在口服給藥領域的應用，結果表明，在酸性條件下其納米球具有緩釋效果。Valente等[6]以殼聚糖和硫酸葡聚糖為原料制備載牛血清蛋白的納米粒，并與間充質干細胞共同封裝至海藻酸鈉納米粒中形成新型雙藥物遞送系統(tǒng)，結果表明，納米粒通過靜電自組裝，具有粗糙的表面，有利于細胞遷移和黏附，載藥納米粒50h 的累積釋放率為10%，900h 釋放平衡的累積釋放率為35%左右。Martins 等[7]制備N,N,N-三甲基殼聚糖，與海藻酸鈉復合制備聚電解質復合物，研究其對姜黃素的釋放，結果表明，其在模擬胃液中30h 釋放平衡的累積釋放率為20%。綜上所述，靜電作用對殼聚糖及其衍生物自組裝行為及藥物釋放行為具有一定的影響，目前靜電作用的自組裝研究主要集中在囊泡、納米粒等方面。在天然高分子共組裝領域，聚陽離子以殼聚糖及季銨化殼聚糖研究較多，聚陰離子則以海藻酸鈉、硫酸葡聚糖研究較多，且研究多為水溶性產物，油溶性產物的共組裝研究鮮有報道?；腔瘹ぞ厶亲鳛樗苄躁庪x子殼聚糖衍生物，不僅具有海藻酸鈉、硫酸葡聚糖所具有的生物相容性和生物可降解性，還具有抗病毒性、抗凝血性、抗菌性和成骨活性等優(yōu)點。本文制備了油溶性的O-磺化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（HSDLCS）和O-季銨化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（QADLCS），合成路線見圖1?？紤]雙親分子單分子膜的性質在一定條件下可預測自組裝囊泡的結構與性質[8]，本文研究了HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜和自組裝囊泡的性能，為進一步研究其自組裝行為提供依據(jù)。

圖1 殼聚糖衍生物HSDLCS 和QADLCS 的合成路線圖

1 實驗部分

1.1 主要試劑及儀器

O-磺化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（HSDLCS）和O-季銨化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（QADLCS），實驗室自制（殼聚糖的相對分子質量為500000；HSDLCS 磺化度為21.67%，烷基化度為177.10%；QADLCS 季銨化度23.69%，烷基化度為178.59%。兩個產物均溶于THF、DMF 和氯仿）[9]；維生素B12，上海國藥集團；其他試劑，均為市售分析純。

JML04S 型雙驅動膜天平，上海中晨數(shù)字技術設備有限公司；UV-3 系列紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；HITACHI S-3500N 掃描電鏡，日本Hitachi 公司；ZEN3600 納米激光粒度及Zeta 電位分析儀，英國malvern 公司。

1.2 HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜的π-A 等溫線測定

將殼聚糖主鏈相對分子質量為500000 制得的HSDLCS 和QADLCS 分別溶解于氯仿中，于25mL容量瓶中配制成10-3mol/L 的溶液，按帶電基團摩爾比1∶1 混合于10mL 容量瓶中。以二次水為亞相進行實驗，用微量進樣器取40μL 樣品溶液，緩慢、均勻地滴加在亞相表面上，待溶液在亞相表面上鋪展并揮發(fā)約30min 后進行壓縮，用Wilhelmy 吊片法測定π-A 等溫線。壓膜速率為20mm/min，室溫(20±1)℃， 實驗重復3 次。配制相同濃度HSDLCS 和QADLCS 溶液，同樣方法測定單組分π-A 等溫線。

1.3 HSDLCS/QADLCS 復合囊泡的制備

0.1g 摩爾比為1∶1 的HSDLCS 和QADLCS 溶解于24mL 氯仿中，加入8mL 濃度為4mg/mL 的維生素B12溶液，冰浴超聲30min 形成W/O 乳液，低溫旋轉蒸發(fā)至膠狀半固體，放置過夜除氯仿。在冰浴下強力超聲10min，冷凍離心40min，分離載藥囊泡和未包封的藥物。同樣方法制備QADLCS、HSDLCS 載藥囊泡及空白囊泡。

1.4 囊泡的粒徑和Zeta 電位測定

將 1.3 節(jié)制得的 QADLCS、HSDLCS 及HSDLCS/QADLCS 自組裝囊泡制成囊泡-水懸混液，采用納米激光粒度及Zeta 電位分析儀在25℃下測定空白囊泡的粒徑分布及Zeta 電位。

1.5 自組裝囊泡的載藥性能和藥物釋放行為

將載藥囊泡放入透析袋并置于25mL 純水中，間隔1h 取出3mL 透析液，再補充3mL 蒸餾水。透析液在UV361nm 測定吸光值，根據(jù)B12標準曲線方程計算藥物釋放量（ C=0.05829A-0.00036 ，r=0.9995，線性范圍5.36×10-3～5.36×10-2mg/mL），繪制載藥囊泡釋放曲線。由公式包封率=(M1＋M2)/M×100%和載藥量=(M1＋M2)/M3（其中M1、M2、M3和M 分別為釋藥平衡時藥物總釋放量、未釋放藥物的質量、囊材的質量和總投藥量；M2是由乙醇破壞囊泡后離心得到的上清液，采用UV 測定吸光值并由B12標準曲線方程計算得到），計算包封率和載藥量。

2 結果與討論

2.1 HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜性質

2.1.1 混合單分子膜的π-A 等溫線

按照實驗部分1.2 的操作測得產物單分子膜的π-A 等溫線如圖2 所示，a、b、c 分別為O-磺化-N,N-雙十二烷基殼聚糖（HSDLCS）、O-季銨化-N,N-雙十二烷基殼聚糖（QADLCS）及HSDLCS/QADLCS混合單分子膜的π-A 曲線。由圖2 可見，HSDLCS、QADLCS 及混合單分子膜的π-A 等溫線都較為平滑，無明顯的液態(tài)擴張相-液態(tài)凝聚相（LE-LC）轉變，崩潰壓均在35mN/m 以上，說明三者均可在水面上形成穩(wěn)定的單分子膜。從π-A 曲線得到相應的崩潰壓和極限分子面積見表1。由圖2 和表1 可以看出，HSDLCS 的分子極限面積較QADLCS 低，這是因為與 HSDLCS 的磺酸鹽基團相比較，QADLCS 的季銨鹽基團空間阻礙作用較大，且基團間存在靜電作用及水化層[10]，從而影響了單分子膜分子間距離，導致QADLCS 的分子平均占有面積增大，所成的單分子膜較為擴張。與單組分產物相比，HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜的崩潰壓（46.14mN/m）和極限分子面積較大，這可能是因為二者在形成單分子膜時，親水基團進入水相中，基團之間易形成靜電相互作用，使膜壓縮至崩潰時需要的壓力更大，故崩潰壓更大。但季銨鹽陽離子周圍有3 個甲基的屏蔽，在一定程度上阻礙了陰陽離子表面活性劑極性頭基相互靠近，使得分子的平均占有面積更大，形成的單分子膜較為擴張[11]。

圖2 HSDLCS、QADLCS 及其混合單分子膜的π-A 等溫線 （1?2=10-20m2）

表1 HSDLCS、QADLCS 及其復合單分子膜的崩潰壓、極限分子面積和最大壓縮模量

2.1.2 混合單分子膜的Cs-1-A 曲線

2.2 HSDLCS/QADLCS 復合囊泡的性質

2.2.1 自組裝囊泡的SEM 圖

圖3 HSDLCS、QADLCS 及其混合單分子膜的Cs-1-A 曲線

按照實驗部分1.3 節(jié)的方法制備HSDLCS/ QADLCS 復合囊泡。囊泡的SEM 圖如圖4 所示，可見，復合自組裝形成的囊泡接近于球形，粒徑在200～400nm。

圖4 HSDLCS/QADLCS 復合自組裝囊泡的SEM 圖

2.2.2 囊泡的粒徑大小、分布及Zeta 電位

按照實驗部分1.4 節(jié)的操作測得囊泡的粒徑分布及Zeta 電位見表2。QADLCS、HSDLCS 和HSDLCS/QADLCS 自組裝囊泡的Zeta 電位分別為49.4mV、-42.4mV 和-6.94mV，單組分囊泡的Zeta電位絕對值均大于 30mV，說明 QADLCS 和HSDLCS 自組裝囊泡能夠穩(wěn)定存在。 而HSDLCS/QADLCS 復合囊泡的Zeta 電位較小，說明復合囊泡進行自組裝時HSDLCS 的—SO3-基團與QADLCS 的—N(CH3)3+基團間存在靜電作用[12]，二者按比例復合后Zeta 電位不為0，則因為兩者均由高相對分子質量殼聚糖制備而成，長鏈分子本身容易形成纏結和嵌套等結構，在空間位阻效應、靜電作用及疏水作用的共同作用下，HSDLCS 分子鏈上的負電荷未能完全與QADLCS 分子鏈中的正電荷靜電結合，導致兩者形成囊泡時的電位不符合兩者完全復合的化學計量比[13]。

由表2 可以看出，QADLCS、HSDLCS 和HSDLCS/QADLCS 自組裝囊泡粒徑分別為345.6nm、344.3nm 和 359.9nm，比SEM 中粒徑略大。HSDLCS/QADLCS 復合囊泡的粒徑較單組分囊泡略大，這可能是因為季銨鹽基團為正四面體結構，空間位阻較大，在一定程度上阻礙了陰陽離子表面活性劑極性頭基相互靠近[11]。3 種囊泡的多分散系數(shù)均在0.1～0.2，說明囊泡的粒徑比較均勻，具有單分散性。

表2 自組裝囊泡的粒徑大小、分布及Zeta 電位

2.2.3 囊泡的載藥性能及釋放行為

以維生素B12為模型藥物，按照實驗部分1.3節(jié)的方法制備載藥囊泡，測得載藥量和包封率如表3 所示，與單組分囊泡相比，復合囊泡的載藥量和包封率較高。

表3 HSDLCS、QADLCS 及其復合囊泡的載藥量和包封率

載藥囊泡的釋放行為見圖5，a、b、c 分別為QADLCS、HSDLCS 載藥囊泡以及 HSDLCS/ QADLCS 復合載藥囊泡的釋放曲線?？梢姡? 種囊泡均有緩釋作用，在30h 左右達到釋藥平衡，其平衡釋放率分別為42.14%、38.16%和23.68%，藥物釋放速率和平衡釋放量順序為QADLCS＞HSDLCS＞HSDLCS/QADLCS 載藥囊泡，說明三者中復合囊泡的通透性最低，膜結構較為緊密，這與單分子膜結果一致。與HSDLCS 結構中的磺酸鹽基團相比，季銨鹽基團由于空間占有較大且基團間存在一定的靜電排斥作用，使得QADLCS 囊泡結構較為疏 松[14]。而HSDLCS/QADLCS 復合囊泡由于正、負離子極性頭基之間存在強烈的靜電作用，容易形成離子對結構[4]，在靜電作用和疏水作用的共同驅動下，復合囊泡具有更有序的結構，藥物通透性降低。

圖5 自組裝囊泡的藥物釋放曲線

2.3 囊泡性質與相應單分子膜性質的關系

囊泡的釋放行為取決于囊泡分子膜的藥物通透性，而單分子膜的最大壓縮模量可以在一定程度上反映囊泡膜結構的緊密程度，通過對兩者關系的考察可以建立單分子膜與相應自組裝囊泡性質間的聯(lián)系[8，15]，為進一步研究產物結構、單分子膜、囊泡三者之間的關系提供理論依據(jù)。殼聚糖衍生物QADLCS、HSDLCS 及HSDLCS/QADLCS 單分子膜的最大壓縮模量與其相應自組裝載藥囊泡藥物平衡釋放率關系如圖6 所示。從圖6 中可以看出，隨著產物單分子膜最大壓縮模量的增加，其相對應自組裝載藥囊泡的藥物平衡釋放率降低，并呈現(xiàn)一定的線性關系，說明殼聚糖衍生物結構不同會導致單分子膜性質及囊泡性質的改變，通過產物單分子膜的最大壓縮模量能在一定程度上對囊泡結構緊密程度進行預測。

圖6 產物單分子膜性質與相應自組裝囊泡性質之間的關系

3 結 論

制得 O- 磺化-N,N- 雙十二烷基殼聚糖（HSDLCS）和O-季銨化-N,N-雙十二烷基殼聚糖（QADLCS），研究HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜和自組裝囊泡性質的關系。結果表明，與單組分產物單分子膜性質相比，HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜具有較大的崩潰壓和壓縮模量；自組裝囊泡HSDLCS 和QADLCS 的Zeta 電位絕對值大于30mV，能夠穩(wěn)定存在，而HSDLCS/QADLCS 復合囊泡的Zeta 電位較低；HSDLCS/QADLCS 復合囊泡具有較高的載藥量和包封率，較低的藥物釋放率和平衡釋放量。3 種單分子膜的最大壓縮模量與其相應載藥囊泡藥物平衡釋放率呈一定的線性關系。這些結果為進一步研究HSDLCS/QADLCS 混合自組裝行為提供依據(jù)。

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