王愛玲 王海燕 覃慧林 馮天艷 賀海波 楊小姣 鄧 為 汪鋆植

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 ＆湖北省土家醫(yī)藥研究所，湖北 宜昌 443002；2.湖北省宜昌市中醫(yī)醫(yī)院 ＆三峽大學(xué) 中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；3.神農(nóng)架聚能藥業(yè)有限公司，湖北 神農(nóng)架 422400）

南赤瓟為葫蘆科植物Thldianthanudiflora Hemsl.的根，又名野南瓜、毛土瓜、球子蓮，四棍汝等，其性味苦，涼，具有清熱解毒、理氣活血、瀉熱祛瘀、消腫散結(jié)、止痢通乳的功效［1］，民間主要用于治療癰腫、腸炎、痢疾、毒蛇咬傷、通乳及婦科疾病.在前期研究中，發(fā)現(xiàn)南赤瓟水提物和醇提物可顯著誘導(dǎo)Hela和 Caski細胞凋亡［2－3］.本研究擬在此基礎(chǔ)上通過裸鼠宮頸癌Caski移植瘤模型，觀察南赤瓟醇提物對裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的抑制作用，并在此基礎(chǔ)上探尋其可能的機制，以期為其用于宮頸癌的臨床治療提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 南赤瓟醇提物的制備

南赤瓟醇提物的制備參見前期研究報道［3］.實驗時將南赤瓟醇提物干浸膏，實驗時用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成所需濃度.

1.2 實驗細胞及動物

人宮頸癌Caski細胞株購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供；雌性BALB／c－nu裸鼠15只，4～6周齡，體重18～22g，由武漢大學(xué)動物中心提供，飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周后即進行成瘤實驗.

1.3 藥品及主要試劑

RPMI－1640，美國Gibco公司；胎牛血清，杭州四季青生物材料有限公司；HEPES，胰蛋白酶，美國Amresco公司；Annexin V－FITC，晶美生物工程有限公司；Trizol，美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit），日本 TaKaRa公司，Bcl－2、Bax、Caspase－9、Caspase－3和 GAPDH（引物序列見表1）、即用PCR擴增試劑盒（Tap DNA Polymerase），生工生物工程（上海）有限公司；其他試劑均為市售分析純.

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)和動物模型的建立

Caski細胞培養(yǎng)于含10%新生小牛血清、105U／L青霉素、100mg／L鏈霉素的 RPMI－1640培養(yǎng)基中，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的飽和濕度條件下培養(yǎng)，待Caski細胞貼壁生長，取對數(shù)生長期細胞，制備單細胞懸液，調(diào)整密度至4×107個／mL，裸鼠于右側(cè)后腿背部皮下注射0.3mL／只單細胞懸液，注射局部出現(xiàn)明顯皮丘，一周內(nèi)注射2次.待腫瘤長出后，每日測量腫瘤體積，待瘤體生長至大于100mm3時，進行實驗.

1.4.2 實驗分組

待瘤體生長至大于100mm3后，將裸鼠完全隨機分為3組：模型組，南赤瓟醇提物組（200mg／kg）和南赤瓟醇提物組（400mg／kg），每組5只，每組灌胃給予相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)給藥4周.

1.5 觀察指標

1.5.1 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠一般情況的影響

每3d測量1次裸鼠體重、飲食量、飲水量，每天觀察裸鼠的精神狀態(tài)、活動力、反應(yīng)、腫瘤生長情況、大便形態(tài)等.分組后第2d（d1）開始測量各組移植瘤的長度（L）和寬度（W），每3d測量1次，腫瘤體積（V）＝（L×W2）／2，以觀測時間（d）作為橫軸，瘤體積的均值（mm3）為縱軸繪制移植瘤生長曲線.

1.5.2 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影響

停藥后24h將裸鼠脫頸法處死，完整剝出瘤組織，觀察各組瘤塊情況及有無周圍組織浸潤，常規(guī)剖腹觀察有無腹水及其它臟器轉(zhuǎn)移，稱瘤體重量，計算抑瘤率.抑瘤率＝［1－（治療組瘤重／對照組瘤重）］×100%.

1.5.3 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織細胞凋亡的影響

取瘤組織約10mm3，用4℃的PBS清洗2次，用眼科剪反復(fù)剪碎組織塊后，200目尼龍網(wǎng)過濾2次，制成單細胞懸液；取2×107細胞，用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測，具體方法參見Annexin V－FITC試劑盒說明書.

1.5.4 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

取瘤后，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色后，置于光鏡下觀察各組裸鼠移植瘤組織的形態(tài)學(xué)變化.

1.5.5 南赤瓟醇提物對腫瘤組織 Bcl－2、Bax、Caspase－3和Caspase－9mRNA表達的影響

用Trizol試劑提取移植瘤組織總RNA，具體方法遵照說明書進行，然后將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；在RNase Free處理過的反應(yīng)管中加入SYBR? Premix Ex TaqTM II（2X）12.5μL，PCR Forward Primer（10μM）1μL，PCR Reverse Primer（10μM）1 μL，DNA 模板2μL，滅菌蒸餾水8.5μL，最終反應(yīng)體系為25μL.將樣品放入實時定量PCR擴增儀中按95℃預(yù)變性30s、95℃變性5s、退火30s、72℃延伸20 s條件擴增30次.利用PCR儀匯出擴增曲線，進行結(jié)果分析.

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用One－Way ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標準.

2 結(jié) 果

2.1 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠一般情況的影響

Caski細胞接種后第10d起，裸鼠右側(cè)后腿背部出現(xiàn)黃豆大小的移植瘤，15只裸鼠全部成瘤，用藥前各組間平均腫瘤體積大小無顯著性差異（P＞0.05）.用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，各組裸鼠的進食量、飲水、大小便均正常，精神狀態(tài)良好，活動正常，反應(yīng)敏捷，皮膚顏色如常，移植瘤組織未見破潰.

2.2 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤體積的影響

由圖1可見，模型組的移植瘤生長迅速，用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，腫瘤體積雖然繼續(xù)增大，但生長速度明顯變緩，從治療后第7d開始，與模型組比較，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），且隨著治療時間的延長，其療效愈加明顯.

圖1 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤體積的影響（與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

2.3 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

由表2可知，模型組瘤體積和瘤重明顯增加，用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，其瘤重明顯降低，與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；其抑瘤率隨劑量的增加而逐漸增高，與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.01）.

表2 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠瘤重、抑瘤率和細胞凋亡的影響（x±s，n＝5）

2.4 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織細胞凋亡的影響

模型組瘤組織的細胞凋亡率比較低，用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，其腫瘤細胞凋亡明顯增加，與模型組比較，具有顯著性差異，且隨著南赤瓟提取物劑量增加凋亡率提高（P＜0.01）（見表2）.

2.5 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

圖2 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

由圖2可見：模型組腫瘤細胞細胞核增大，核呈2個或多個，大小、形態(tài)不一，核仁清晰，染色質(zhì)增多，核膜顯著增厚；用南赤瓟醇提物治療后，瘤細胞出現(xiàn)皺縮，細胞質(zhì)密集，核染色質(zhì)邊集，可見細胞凋亡，并有壞死區(qū)域出現(xiàn)，而且隨南赤瓟醇提物劑量的增加，凋亡細胞明顯增多，壞死區(qū)域出現(xiàn)顯著增大.

2.6 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織Bcl－2、Bax mRNA表達影響

如表3所示，模型組腫瘤組織中Bcl－2mRNA表達水平明顯增加，Bax mRNA表達水平明顯降低；用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，Bcl－2mRNA表達明顯降低，Bax mRNA表達明顯升高，Bcl－2／Bax的比值降低，與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），且隨著南赤瓟醇提物劑量增加而增強.

表3 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織Bcl－2、Bax mRNA表達的影響（x±s，n＝5）

2.7 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織 Caspase－3、Caspase－9mRNA表達的影響

如表4所示，模型組腫瘤組織中Caspase－3、Caspase－9mRNA表達水平明顯降低；用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，腫瘤組織中Caspase－3、Caspase－9mRNA表達水平明顯升高，與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），且隨著南赤瓟醇提物劑量增加而增強.

表4 南赤瓟醇提物對Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織Caspase－3、Caspase－9mRNA表達的影響（x±s，n＝5）

3 討 論

宮頸癌是臨床最常見的婦科惡性腫瘤，由于其惡性程度高，多易復(fù)發(fā)，而且死亡率高，使得當(dāng)前已成為全球性的公共衛(wèi)生問題［4］.據(jù) WHO統(tǒng)計統(tǒng)計，全球每年新發(fā)宮頸癌病例有55.51萬，其中我國就有13.15萬，占新發(fā)病例28.8%［5－6］.尤其應(yīng)該關(guān)注的是，當(dāng)前我國宮頸癌的發(fā)病率不僅出現(xiàn)明顯的上升趨勢，而且呈現(xiàn)底年齡化.因而，在我國宮頸癌的防治任務(wù)顯得尤為艱巨［3，7］.目前在宮頸癌的綜合治療中，除手術(shù)、放療之外，化療是防治該腫瘤的重要手段之一，但由于當(dāng)前的一線化療藥物費用昂貴，加之毒副作用大，極大的增加了患者的負擔(dān)和痛苦.因此，新型的高效、低毒的化療藥物亟待開發(fā).近年來，許多少數(shù)民族地區(qū)流傳使用的草藥以毒性低、安全范圍廣、藥源豐富越來越受到人們的關(guān)注，已成為腫瘤治療領(lǐng)域的一大特色.南赤瓟作為土家族民間草藥，主要用來治療癰腫、腸炎、痢疾、毒蛇咬傷，通乳及婦科疾病.我們前期發(fā)現(xiàn)其水提物和醇提物可顯著誘導(dǎo)Hela和Caski細胞凋亡［2－3］.本研究擬在此基礎(chǔ)上通過裸鼠宮頸癌Caski移植瘤模型，觀察南赤瓟醇提物對對裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的抑制作用，并在此基礎(chǔ)上探尋其可能的機制，為此我們設(shè)計了此實驗.研究發(fā)現(xiàn)，南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）可顯著抑制瘤體組織中的腫瘤細胞增殖，且隨南赤瓟醇提物劑量增加，其瘤體積、瘤重均明顯減小，抑瘤率顯著增大，與模型組比較具有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）.細胞形態(tài)改變和細胞凋亡是評價抗腫瘤藥物的重要依據(jù)，本實驗通過HE染色和細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，Caski細胞移植瘤裸鼠用南赤瓟醇提物治療后，腫瘤組織的形態(tài)學(xué)也發(fā)生改變，出現(xiàn)腫瘤細胞凋亡及壞死；流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，南赤瓟醇提物可顯著誘導(dǎo)導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，而且隨著其劑量的增加其作用效果愈加明顯.實驗結(jié)果表明，南赤瓟醇提物對裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的生長具有顯著的抑制作用，該作用主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡來實現(xiàn)的.

總所周知，細胞凋亡是生物體細胞在正常生理或病理狀態(tài)下所發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程，通常情況下，該過程受到生物體信號網(wǎng)絡(luò)的嚴密調(diào)控［8－9］.在總舵 的 調(diào) 控 因 素 中，Bcl－2 家 族 最 受 備 受關(guān)注，通常情況下，Bcl－2基因在細胞凋亡的上游發(fā)揮調(diào)控作用，它通過和Bax結(jié)合形成異源二聚體，來抑制Bax的促凋亡作用；當(dāng)Bax表達升高時，由于Bax同源二聚體形成增多，使得細胞凋亡加速；反之，當(dāng)Bcl－2表達升高時，會加速Bax同源二聚體解離，進而形成Bcl－2／Bax異源二聚體，發(fā)揮抑制細胞凋亡作用，因此Bcl－2／Bax的比值常常決定著細胞的存活或死亡［3］.本研究中，我們發(fā)現(xiàn)南赤瓟醇提物可顯著地升高Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織中Bax mRNA表達，降低Bcl－2mRNA表達和Bcl－2與Bax的比值.實驗結(jié)果表明，南赤瓟醇提物對裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的細胞凋亡促進作用可能與其調(diào)節(jié)Bcl－2和Bax基因表達水平有關(guān).

在細胞凋亡的調(diào)控通路中，除Bcl－2家族參與細胞凋亡外，細胞質(zhì)中的Caspase蛋白激酶家族在這一過程扮演了重要角色［10］.總所周知，在凋亡過程中，Bcl－2家族在細胞凋亡的上游過程發(fā)揮作用，而Caspase蛋白激酶家族則在下游發(fā)揮作用，在這一過程中有多種促凋亡和抗凋亡的蛋白相互博弈來決定著細胞命運.比如，Bcl－2家族基因異常表達，使得Bcl－2／Bax比值降低，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，使細胞色素C從線粒體釋放到胞漿中，與凋亡蛋白酶活化因子－1和Caspase－9的前體結(jié)合形成凋亡小體，來激活Caspase－9，再酶解Caspase－3前體，釋放出C末端小肽片段，從而活化Caspase－3，然后瀑布式激活Caspase－2，Caspase6，Caspase8，Caspase10等蛋白激酶.最終激活脫氧核糖核酸酶，水解核酸和細胞骨架蛋白，導(dǎo)致細胞凋亡［3，11－12］.因此，激活 Caspase－9及Caspase－3是細胞凋亡的必經(jīng)之路.本研究中，我們發(fā)現(xiàn)南赤瓟醇提物可顯著升高Caski細胞移植瘤裸鼠腫瘤組織中Caspase－9及Caspase－3的mRNA表達水平，其實驗結(jié)果與腫瘤組織形態(tài)學(xué)和細胞凋亡分析結(jié)果一致.

綜上所述，南赤瓟醇提物可顯著抑制裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的生長，促進瘤體腫瘤細胞的凋亡，且呈明顯的劑量依賴性，并初步證實其機制可能與上調(diào)Bax、Caspase－9、Caspase－3和下調(diào) Bcl－2凋亡相關(guān)的基因表達有關(guān)..

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