宋菲，王齊齊，王揮，黃玉林，陳衛(wèi)軍，趙松林（.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌57339；.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?708）

檳榔花中酚類物質(zhì)對(duì)HSF細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

宋菲1，王齊齊2，王揮1，黃玉林1，陳衛(wèi)軍1，趙松林1
（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌571339；2.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

摘要：為了探討檳榔花中3種主要酚類物質(zhì)（表兒茶素、沒食子酸、香豆酸）對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）氧化損傷的保護(hù)作用，以H2O2（150 μmol/L）處理HSF細(xì)胞24 h，建立氧化損傷模型，MTT法測定細(xì)胞存活率，分光光度法檢測細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力和線粒體膜腫脹度，DCFH-DA染色法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量。結(jié)果表明表兒茶素和沒食子酸均能改善H2O2引起的HSF細(xì)胞的氧化損傷，而香豆酸卻沒有保護(hù)作用。與H2O2模型組相比，表兒茶素和沒食子酸均能提高氧化損傷細(xì)胞的存活率，并將細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力提高了4.73%～31.66%，細(xì)胞內(nèi)活性氧和線粒體膜腫脹度也明顯降低。表明檳榔花中2種主要的酚類物質(zhì)表兒茶素和沒食子酸對(duì)HSF細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：檳榔花；酚類物質(zhì)；HSF細(xì)胞；氧化損傷

檳榔（Areca catechu L.）為棕櫚科檳榔屬常綠喬木，主要分布在中非和東南亞[1]，在我國主要分布在海南、臺(tái)灣等地。檳榔花為檳榔的雄花蕾，是檳榔的主要副產(chǎn)物，在每年3～8月份產(chǎn)花，開花多、花期長。檳榔花含有多酚、多糖、生物堿等多種生理活性物質(zhì)以及對(duì)人體有益的微量元素，具有獨(dú)特的食療和保健功效[2-3]，以“微型營養(yǎng)品”和“長壽食品”著稱。在海南常用來做保健食品的原料，廣受人們的喜愛。

目前對(duì)檳榔花提取物活性成分的研究主要集中在多酚類物質(zhì)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)檳榔花提取物含有多種酚類物質(zhì)，包括沒食子酸、香豆酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁和柚皮素等[4]，但含量各不相同，而且酚類物質(zhì)的提取率受提取溶劑及提取方法的影響。研究還發(fā)現(xiàn)檳榔花多酚具有較強(qiáng)的抗氧化性及清除自由基的能力[5-7]。本文選取檳榔花中含量相對(duì)較高的3中酚類物質(zhì)，研究其對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞HSF氧化損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步明確檳榔花多酚類物質(zhì)的抗氧化作用，以期為檳榔花功能產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

表兒茶素、沒食子酸、香豆酸、MTT、二甲基亞楓（DMSO）、DCFH-DA：美國sigma公司；人皮膚成纖維細(xì)胞HSF：中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供；細(xì)胞總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；DMEM培養(yǎng)基、胰酶（Trypsin）：美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程材料有限公司；其他均為AR級(jí)試劑。

1.2主要儀器

Thermo scientific varioskan ascent FL熒光測讀儀；WJ-185I CO2培養(yǎng)箱；leica倒置顯微鏡；TDZ4-WS離心機(jī)；ZHJH-1109B超凈工作臺(tái)等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞氧化損傷模型的建立

HSF細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2，溫度37℃，飽和濕度。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用0.25%胰酶消化后用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，以1.5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)后，加入含H2O2的培養(yǎng)基，孔內(nèi)H2O2終濃度為50、100、150、200 μmol/L，作用24 h后，檢測細(xì)胞存活率。本實(shí)驗(yàn)中每組設(shè)置6個(gè)平行復(fù)孔，不含H2O2的為正常對(duì)照組，以正常對(duì)照組的細(xì)胞存活率為100%，選取致死率接近50%的H2O2濃度作為氧化損傷模型的濃度。

1.3.2酚類物質(zhì)對(duì)HSF細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

試驗(yàn)分為正常對(duì)照組、H2O2模型組、酚類物質(zhì)（表兒茶素、沒食子酸、香豆酸）保護(hù)組。正常對(duì)照組不做任何處理，H2O2模型組用含終濃度150 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，酚類物質(zhì)保護(hù)組用含終濃度為150 μmol/L H2O2和不同濃度酚類物質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表兒茶素的作用濃度確定為0.1、1、10 μg/mL，沒食子酸和香豆酸的作用濃度為2、10、50 μg/mL。

1.3.3細(xì)胞存活率的測定

細(xì)胞存活率的測定采用MTT法[8]。96孔板中分組處理的細(xì)胞結(jié)束培養(yǎng)后，加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37℃孵育4h，吸除上清液，加150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解，550nm波長下測定各孔吸光度（A）。

細(xì)胞存活率/%=（[試驗(yàn)孔A-空白A）（/正常對(duì)照孔A-空白A）]×100

1.3.4細(xì)胞總抗氧化能力的測定

式中：ODu為測定管吸光度值；ODc為對(duì)照管吸光度值；N為反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（反應(yīng)液總體系/取樣量）；C為待測樣本蛋白濃度，mg/mL。

1.3.5細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的測定

細(xì)胞內(nèi)活性氧的測定采用熒光染料DCFH-DA染色，熒光測讀儀測定[9-10]。細(xì)胞懸液以3×105個(gè)/mL接種于6孔板中，毎孔2 mL，按1.3.2所述方法進(jìn)行分組處理和培養(yǎng)，收集處理后的細(xì)胞，加入終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA 1 mL，37℃避光孵育15 min，熒光測讀儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長為525 nm。

1.3.6線粒體膜腫脹度測定

收集分組處理后的細(xì)胞，12 000 r/min離心5 min，放入冰箱中反復(fù)凍融3次?？捡R斯亮藍(lán)染色法測定線粒體蛋白濃度，取50 μg蛋白加入到總體積為200 μL的反應(yīng)緩沖液中（250 mmol/L蔗糖、5 mmol/L KH2P04、3 mmol/L琥珀酸鈉，pH 7.2），混勻后記錄520 nm處吸光度值，測定過程保持25℃恒溫[11-12]。

1.3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均來自于3次以上獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用Student's t-test比較兩組間差異，P＜0.05代表統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異，P<0.01代表統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有高度顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷作用

H2O2是一種重要的活性氧，具有良好的細(xì)胞膜滲透性，可以輕易的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，引起脂質(zhì)過氧化、DNA損傷等，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒作用[13]。為了建立H2O2對(duì)HSF細(xì)胞的氧化損傷模型，采用不同濃度的H2O2（終濃度為0、50、100、150、200 μmol/L）處理HSF細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率的結(jié)果見圖1。

隨著H2O2濃度的增大，細(xì)胞存活率逐漸減低，且呈濃度依賴性。濃度范圍在100 μmol/L～200 μmol/L時(shí)，H2O2對(duì)HSF細(xì)胞產(chǎn)生顯著的毒性作用（P<0.01）。150 μmol/L H2O2作用24 h后，HSF細(xì)胞死亡率達(dá)到50.62%，故選擇此濃度建立模型。

圖1　不同濃度H2O2對(duì)HSF細(xì)胞存活率的影響Fig.1　Effects of different concentration of H2O2on HSF cell viability

2.2酚類物質(zhì)對(duì)氧化損傷的HSF細(xì)胞的保護(hù)作用

HSF細(xì)胞在H2O2損傷24 h后，在檳榔花中3種主要酚類物質(zhì)（表兒茶素、沒食子酸、香豆酸）的保護(hù)下，細(xì)胞存活率的結(jié)果見表1。

表1　檳榔花中3種酚類物質(zhì)對(duì)氧化損傷的HSF細(xì)胞存活率的影響（n=8，±s）Table 1　Phenolic compounds in Areca inflorescence inhibits the reduction of cell viability induced by H2O2in HSF cells（n=8，±s）

表1　檳榔花中3種酚類物質(zhì)對(duì)氧化損傷的HSF細(xì)胞存活率的影響（n=8，±s）Table 1　Phenolic compounds in Areca inflorescence inhibits the reduction of cell viability induced by H2O2in HSF cells（n=8，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

如表1所示，表兒茶素濃度為0.1 μg/mL～10 μg/mL時(shí)，可將細(xì)胞存活率提高4.81%～35.28%，沒食子酸濃度為2 μg/mL～50 μg/mL時(shí)，可將細(xì)胞存活率提高2.38%～24.82%，香豆酸濃度為2 μg/mL～50 μg/mL時(shí)，對(duì)HSF細(xì)胞沒有明顯的保護(hù)作用，而且高濃度的香豆酸會(huì)引起細(xì)胞死亡率的升高。綜上所述，檳榔花中主要的酚類物質(zhì)表兒茶素和沒食子酸對(duì)HSF細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，而香豆酸則沒有保護(hù)作用。

2.3酚類物質(zhì)增強(qiáng)氧化損傷的HSF細(xì)胞的總抗氧化能力

為了明確表兒茶素和沒食子酸對(duì)H2O2引起的HSF細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，檢測細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力。

圖2　表兒茶素和沒食子酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力的影響Fig.2　Effects of epicatechin and gallic acid on the total antioxidant capacity in H2O2-treated HSF cells

從圖2可以看出，H2O2模型組抗氧化能力較正常對(duì)照組顯著降低（P<0.01），為對(duì)照組的60.23%，而表兒茶素和沒食子酸保護(hù)組可顯著抑制H2O2造成的細(xì)胞總抗氧化能力的下降，表兒茶素保護(hù)組（0.1、1、10 μg/mL）的總抗氧化能力分別提高到了正常組的75.69%、82.63%和91.89%，分別比H2O2模型組提高了15.46%、22.40%和31.66%。沒食子酸保護(hù)組（2、10、50 μg/mL）的總抗氧化能力分別提高到了正常組的64.96%、73.17%和79.46%，分別比H2O2模型組提高了4.73%、12.94%和19.23%。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，表兒茶素和沒食子酸均能通過提高H2O2誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞內(nèi)的總抗氧化能力來減輕細(xì)胞受到的氧化損傷。

2.4酚類物質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧和線粒體膜腫脹度的影響

DCFH-DA本身不發(fā)熒光，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解為發(fā)光的DCFH，而DCFH能停留在細(xì)胞內(nèi)，因?yàn)槠洳荒芡高^細(xì)胞膜流出。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以將DCFH氧化為DCF，因此，檢測DCF熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱就可以評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的高低[14]。如表2所示，150 μmol/LH2O2模型組的DCF熒光強(qiáng)度明顯升高，即ROS明顯升高。而加入表兒茶素和沒食子酸進(jìn)行保護(hù)后，DCF熒光強(qiáng)度較H2O2模型組要降低，說明表兒茶素和沒食子酸能降低H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)ROS的升高。

H2O2作用24 h后，可損傷HSF細(xì)胞的線粒體膜，表現(xiàn)為A520 nm值降低（即線粒體腫脹），表兒茶素和沒食子酸可抑制線粒體膜的腫脹，表明線粒體膜受到了保護(hù)。

表2　表兒茶素和沒食子酸對(duì)HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧和線粒體腫脹度的影響（n=3，±s）Table 2　The effects of epicatechin and gallic acid on ROSgeneration and mitochondria swelling in HSF cells（n=3±s）

表2　表兒茶素和沒食子酸對(duì)HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧和線粒體腫脹度的影響（n=3，±s）Table 2　The effects of epicatechin and gallic acid on ROSgeneration and mitochondria swelling in HSF cells（n=3±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

線粒體膜腫脹（A520 nm）對(duì)照組　8.010±0.711　0.940±0.034 H2O2模型組　12.203±0.318　0.749±0.036表兒茶素保護(hù)組　0.1　8.970±0.070**　0.925±0.009** 1　8.357±0.103**　0.815±0.019** 10　8.167±0.186**　0.825±0.018沒食子酸保護(hù)組　2　10.277±0.168**　0.803±0.009* 10　9.333±0.127**　0.829±0.005** 50　8.843±0.116　0.891±0.012

3　討論

研究表明檳榔花中含有大量的酚類化合物，并且具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，但檳榔花中主要酚類物質(zhì)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞HSF的作用未見報(bào)道，本文通過構(gòu)建H2O2對(duì)HSF細(xì)胞的氧化損傷模型，探討檳榔花中主要的酚類物質(zhì)對(duì)HSF細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明表兒茶素和沒食子酸對(duì)HSF細(xì)胞具有保護(hù)作用，而香豆酸對(duì)HSF細(xì)胞沒有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步明確了檳榔花多酚的抗氧化作用，進(jìn)而為檳榔花多酚類物質(zhì)的利用提供新思路。

細(xì)胞總抗氧化能力是衡量細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)功能的指標(biāo)，大量研究報(bào)道H2O2作用于細(xì)胞后，會(huì)顯著降低細(xì)胞內(nèi)的總抗氧化能力，從而引起細(xì)胞毒性[15-16]。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)30 μmol/LH2O2作用Neuro-2A細(xì)胞24 h后，細(xì)胞總抗氧化能力顯著降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明150 μmol/L H2O2作用24 h后，HSF細(xì)胞死亡率達(dá)到50.62%，細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力與對(duì)照組相比下降39.77%，而在不同酚類物質(zhì)（表兒茶素和沒食子酸）的保護(hù)作用下，細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力顯著提高。

活性氧ROS是破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境氧化還原平衡狀態(tài)的主要因素之一。過量的ROS會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核糖核酸等發(fā)生不可逆修飾，造成細(xì)胞損傷并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]，是引起多種疾病的主要原因之一[19-20]。本試驗(yàn)證實(shí)表兒茶素和沒食子酸能夠抑制H2O2引起的HSF細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，表明其對(duì)HSF細(xì)胞的保護(hù)作用可能與ROS的清除有關(guān)。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要來源之一，其所產(chǎn)生的氧自由基更易直接破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，使線粒體內(nèi)酶失活，線粒體膜功能受損，導(dǎo)致線粒體呼吸功能損傷[21-22]。我們的試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)H2O2可導(dǎo)致HSF細(xì)胞線粒體膜腫脹，使線粒體功能受到損傷，而表兒茶素和沒食子酸均降低H2O2引起的這種損傷。因此，我們認(rèn)為表兒茶素和沒食子酸是通過清除ROS，進(jìn)而抑制線粒體膜損傷而實(shí)現(xiàn)對(duì)HSF細(xì)胞的保護(hù)作用。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.003

收稿日期：2014-08-25

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金（314146）

作者簡介：宋菲（1986—），女（漢），助理研究員，碩士，研究方向：食品中功能性成分的活性評(píng)價(jià)及產(chǎn)品開發(fā)。

Protective Effects of Phenolic Compounds in Areca Inflorescence on Oxidative Damage in HSF Cells

SONG Fei1，WANG Qi-qi2，WANG Hui1，HUANG Yu-lin1，CHEN Wei-jun1，ZHAO Song-lin1
（1.Coconut Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Wenchang 571339，Hainan，China；2.College of Food，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Abstract：In order to understand the protective effects of 3 kinds of phenolic compounds（epicatechin，gallic acid，coumaric acid）in Areca inflorescence on oxidative damage in human skin fibroblasts cells（HSF），HSF cells were treated with 150 μmol/L H2O2for 24 h and the oxidative damage model was established.Cell viability was measured by MTT method，the total antioxidant capacity and mitochondria membrane swelling degree were detected by spectrophotometry，intracellular reactive oxygen species（ROS）accumulation was measured by DCFH-DA staining method.The results showed that epicatechin and gallic acid could improve the oxidative damage on HSF cells induced by H2O2，whereas coumaric acid had no protective effect.Compared with the H2O2model group，epicatechin and gallic acid can improve the survival rate of HSF cells，the total antioxidant capacity was increased by 4.73%-31.66%，intracellular reactive oxygen species and the mitochondrial swelling decreased.As a results，the two main kinds of phenolic compounds（epicatechin and gallic acid）in Areca inflorescence have protective effects on oxidative damage in HSF cells.

Key words：Areca inflorescence；phenolic compounds；HSF cells；oxidative damage