李婭　支崇遠(yuǎn)　孫翠翠等

摘要：對不同濃度Cd2+中淡水底棲硅藻Nitzschia amplectens的存活數(shù)、葉綠素a含量及運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行測定，以探索硅藻對重金屬毒性的響應(yīng)規(guī)律，為硅藻監(jiān)測水體污染提供科學(xué)依據(jù)。純化培養(yǎng)Nitzschia amplectens，生長數(shù)量達(dá)到7萬個(gè)/mL時(shí)，加入不同濃度的Cd2+進(jìn)行急性毒性和亞急性毒性脅迫培養(yǎng)。在急性毒性試驗(yàn)中，Nitzschia amplectens的存活數(shù)在96 h的EC50值為4.989 mg/L。在亞急性毒性試驗(yàn)中，培養(yǎng)15 d后Cd2+濃度為0.625、0 mg/L的Nitzschia amplectens運(yùn)動(dòng)平均速度為2.5、5.56 μm/s，其余試驗(yàn)組無運(yùn)動(dòng)跡象；培養(yǎng)13 d后，Cd2+濃度與葉綠素a含量呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。Cd2+濃度對Nitzschia amplectens的生長、運(yùn)動(dòng)速度和葉綠素a含量有明顯影響，所以Nitzschia amplectens具監(jiān)測水體重金屬Cd2+污染潛力。

關(guān)鍵詞：Nitzschia amplectens；重金屬Cd2+；培養(yǎng)；生長；運(yùn)動(dòng)；葉綠素a；水質(zhì)監(jiān)測；指示生物

中圖分類號： Q945.78；X832 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0305-03

鎘是一種生物毒性很強(qiáng)的重金屬，能在有機(jī)體內(nèi)積蓄，通過食物鏈傳遞富集可引起生物體生長緩慢甚至死亡[1]。隨著工業(yè)的發(fā)展，大量的Cd2+向環(huán)境中排放，使得環(huán)境中的Cd2+污染加重。中國水體鎘污染時(shí)有發(fā)生，2012年1月15日廣西龍江河宜州拉浪段發(fā)現(xiàn)重金屬鎘超標(biāo)，至1月21日18時(shí)污染事件已造成約28.1萬尾魚死亡。目前鎘已被美國毒理管理委員會(huì)（ATSDR）列為第6位危及人體健康的有毒物質(zhì)，被聯(lián)合國組織確定為優(yōu)先檢測的環(huán)境污染物[2]。

底棲硅藻是一種單細(xì)胞生物，分布很廣，是水體中的初級生產(chǎn)者，在光合作用下它們吸收水中的無機(jī)鹽和二氧化碳，制造有機(jī)物[3-4]，它們對凈化水質(zhì)具有重要意義。2000年歐共體水框架指南（Water Framework Directive of the European Union）推薦硅藻為水體監(jiān)測生物指標(biāo)。底棲硅藻對許多環(huán)境變量（pH值、光、鹽度、溫度、無機(jī)營養(yǎng)濃度等）敏感[5-6]，它們與水體重金屬關(guān)系的研究已有一些報(bào)道。Nitzschia amplectens Hustedt是中國西南地區(qū)河流中常見淡水底棲硅藻，其與重金屬關(guān)系的系統(tǒng)研究報(bào)道甚少。探索Nitzschia amplectens與Cd2+的關(guān)系，可為生物監(jiān)測水質(zhì)增加新的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 藻種

藻種Nitzschia amplectens Hustedt采集于貴州省烏江上游畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)層臺鎮(zhèn)玉龍鄉(xiāng)河流中段。

1.2 儀器設(shè)備

主要儀器有顯微鏡（NIKON EOLIPSE 50i）、生化培養(yǎng)箱（SPX-250）、水浴鍋、超凈工作臺、離心機(jī)和微量移液器等。

1.3 底棲硅藻自制培養(yǎng)基

1.3.1 培養(yǎng)基基礎(chǔ)液 培養(yǎng)基基礎(chǔ)液配制見表1。

1.3.2 土壤浸出液配制 稱取500 g土壤（土壤采集于貴州省貴陽市相寶山地區(qū)），去離子水1 L，混合后用塑料薄膜封口，沸水浴加熱1 h，冷卻，離心，過濾，取上清液，加蒸餾水至總體積1 000 mL，置于10.1 MPa高溫下滅菌30 min，保存于 4 ℃ 備用。

1.3.3 Nitzschia amplectens培養(yǎng)基 將配制好的培養(yǎng)基基礎(chǔ)液與土壤浸出液以一定的比例混合，用NaOH液將pH值調(diào)至7.5±0.5，經(jīng)0.2 μm濾膜，滅菌，得到Nitzschia amplectens培養(yǎng)基。

1.4 純化培養(yǎng)和脅迫培養(yǎng)

1.4.1 Nitzschia amplectens的分離及純化培養(yǎng) 將野外采集的硅藻樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，用50目的篩絹過濾水樣，放于顯微鏡下觀察，采用微吸管分離法，通過多次抓取，將Nitzschia amplectens藻種分離出來，即可將此放入自制培養(yǎng)基中在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件：溫度（24±1） ℃，光照周期12 h ∶12 h，光照度1 800 lx。每天12：00和19：00搖動(dòng)藻液1 min，以防硅藻附在玻璃壁上。

1.4.2 Cd2+急性毒性脅迫培養(yǎng) 09：00—10：00在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)藻密度，當(dāng)藻種數(shù)量達(dá)到約7萬個(gè)/mL時(shí)，用 500 mL 的培養(yǎng)瓶分裝藻液，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同“1.4.1”節(jié)。

取7個(gè)100 mL培養(yǎng)瓶（1個(gè)對照組+6個(gè)試驗(yàn)組），加入藻液40 mL，藻液密度為7萬個(gè)/mL，再分別在各培養(yǎng)瓶中滴加 Cd2+液，7個(gè)瓶中Cd2+濃度最終調(diào)節(jié)依次為0、0.5、1、2、5、10、15 mg/mL，重復(fù)3次。按“1.4.1”節(jié)培養(yǎng)條件培養(yǎng)，在培養(yǎng)后0、24、48、72、96 h取樣，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，所得數(shù)值通過計(jì)算得出96 h EC50值。先算出抑制率X：X=（I0-I）/I×100%（式中：I0為Cd2+濃度為0時(shí)的特定生長率；I為試驗(yàn)組特征生長率），通過SPSS的Probit分析計(jì)算得出EC50。

1.4.3 Cd2+亞急性毒性脅迫培養(yǎng) 取5個(gè)500 mL培養(yǎng)瓶（1對照組+4試驗(yàn)組），放入藻液200 mL，藻液密度7萬個(gè)/mL，試驗(yàn)組Cd2+濃度梯度設(shè)置為96 h EC50、96 h EC50/2、96 h EC50/4、96 h EC50/8[7]，對照組為空白。進(jìn)行亞急性毒性培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同“1.4.1”節(jié)）。觀察期為15 d，前3 d每天09：00取樣1次，之后每隔2 d取樣1次，每次取樣為10 mL，共計(jì)9次，對所取藻液進(jìn)行葉綠素a含量的測定及對硅藻運(yùn)動(dòng)情況觀測。endprint

隨著Cd2+脅迫培養(yǎng)時(shí)間的延長，Cd2+對Nitzschia amplectens生長的抑制作用增強(qiáng)。96 h的EC50值為4.989 mg/L，根據(jù)藻類生長抑制毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[9]可知，Cd2+對Nitzschia amplectens屬于高毒，對其生長的抑制作用較大。

2.2.2 Cd2+濃度對Nitzschia amplectens運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響 由于硅藻的生殖方式為二分裂生殖，藻的體積會(huì)減小，運(yùn)動(dòng)情況也會(huì)受到影響，所以總體運(yùn)動(dòng)趨勢處于緩慢下降。由圖2可知，經(jīng)過15 d的Cd2+脅迫培養(yǎng)，Cd2+濃度對Nitzschia amplectens的運(yùn)動(dòng)的抑制作用十分明顯。1 d后，藻的運(yùn)動(dòng)速度與Cd2+濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其一元回歸線性方程為y=-0.409x+3.584（P<0.05），在Cd2+濃度為2.495 mg/L的藻液中，所有藻就已停止運(yùn)動(dòng)（Cd2+濃度為4.989 mg/L的藻液中，所有藻停止運(yùn)動(dòng)，未在圖2中標(biāo)出）；在Cd2+濃度為1247 mg/L的藻液中培養(yǎng)7 d后，藻也停止了運(yùn)動(dòng)。由此可見，Cd2+濃度對Nitzschia amplectens的運(yùn)動(dòng)速度有很大的影響。

2.2.3 Cd2+對Nitzschia amplectens葉綠素a含量的影響

藻類的光合作用與其體內(nèi)葉綠素的含量密切相關(guān)，葉綠素的含量若受到影響，則會(huì)影響藻細(xì)胞的生長，因此有必要對在Cd2+脅迫培養(yǎng)下的菱形藻的葉綠素a含量進(jìn)行測定。由圖3可知，在不同濃度Cd2+的條件下對藻培養(yǎng)15 d，前3 d 葉綠素a的總含量變化不是很大；培養(yǎng)后5 d，Cd2+濃度為4.989 mg/L的生長抑制率達(dá)到最大，葉綠素a總含量下降。5 d后，Cd2+濃度為4.989、2.495、1.247 mg/L藻液中的葉綠素a含量基本不再增加，對照組的葉綠素a含量則明顯增加，說明Cd2+對該種菱形藻的的葉綠素a含量有一定影響。計(jì)算13 d后葉綠素含量與Cd2+濃度相關(guān)系數(shù)r=-0.797，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，一元回歸線性方程為y=-0.251x+4.782（P<0.05），說明Cd2+濃度對藻光合作用能力有一定影響，且隨著培養(yǎng)時(shí)間和Cd2+作用時(shí)間的延長而增加影響力度。

3 結(jié)論與討論

生物監(jiān)測是理化監(jiān)測的重要補(bǔ)充，用生物監(jiān)測進(jìn)行配合，充分利用指示生物對污染物毒性反應(yīng)的敏感性，便能較準(zhǔn)確地反映真實(shí)的污染狀況[10]。菱形藻為污水藻，本試驗(yàn)對象選取菱形藻屬中的Nitzschia amplectens，該種生物對重金屬響應(yīng)的報(bào)道極少，而它又是中國西南河流中常見的硅藻種。因此，希望通過本試驗(yàn)可以提供一些科學(xué)數(shù)據(jù)。在預(yù)試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)使用f/2培養(yǎng)基、土壤浸出液以及土壤浸出液和培養(yǎng)基基礎(chǔ)液混合液作為培養(yǎng)基，經(jīng)觀察得出使用土壤浸出液與培養(yǎng)基礎(chǔ)液按一定比例混合后用作培養(yǎng)基中的藻數(shù)量增長最快，藻的運(yùn)動(dòng)情況較好，因此，將其作為本試驗(yàn)中Nitzschia amplectens的培養(yǎng)基。將通過分離和純化培養(yǎng)得到純種Nitzschia amplectens用于不同濃度的Cd2+藻液中進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)和亞急性毒性脅迫培養(yǎng)試驗(yàn)，測定96 h EC50、葉綠素a含量及其運(yùn)動(dòng)的平均速度，并對這些測定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。藻液中的Cd2+濃度與對該藻生長呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且隨著時(shí)間的延長，特別是亞急性毒性脅迫培養(yǎng)試驗(yàn)5 d后，Cd2+濃度對該藻的葉綠素a含量及運(yùn)動(dòng)狀況的影響程度明顯逐漸增強(qiáng)，該反應(yīng)可用于水環(huán)境的檢測。

目前，國內(nèi)外已對多種硅藻受單一重金屬脅迫的影響進(jìn)行了大量研究[11]，將20世紀(jì)90 年代之后微藻受單一重金屬脅迫的LC50或EC50值進(jìn)行總結(jié)，但尚未見Nitzschia amplect的EC50研究報(bào)道。若對比該藻種在Cd2+脅迫培養(yǎng)與其他硅藻[如三角褐指藻（Pheodactylum tricornutum）、新月菱形藻Nitzschia closterium等]的96 h EC50值，其值明顯較大[12]，說明Nitzschia amplectens對Cd2+耐受程度較弱，對Cd2+濃度變化反應(yīng)敏感，可用于監(jiān)測水體中的重金屬Cd2+含量。

一般情況下，重金屬對藻類生理、生化功能的影響主要表現(xiàn)在抑制光合作用、減少細(xì)胞色素、導(dǎo)致畸變以及改變天然環(huán)境中藻類的組成。此外，有關(guān)藻類的DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成及酶活性等方面也有報(bào)道[13]。本試驗(yàn)對Nitzschia amplectens在 15 d 內(nèi)進(jìn)行不同濃度Cd2+亞急性毒性脅迫培養(yǎng)，結(jié)果顯示，藻的葉綠素a含量的增加受到明顯抑制。邱昌恩研究發(fā)現(xiàn)，重金屬離子能通過阻礙光合作用電子傳遞，抻串4蛋白質(zhì)合成，對藻細(xì)胞線粒體形成損傷使葉綠體變形[14]，如葉綠體收縮、類囊體膨脹、基粒結(jié)構(gòu)解體、基質(zhì)減少、質(zhì)體小球大量增加等現(xiàn)象[15-16]，從而降低了藻細(xì)胞中的葉綠素a的含量。藻細(xì)胞生存生長的能量來源于光合作用，而光合作用發(fā)生在葉綠體片層中。類囊體膜上含有各種光臺色素，光合片層基質(zhì)中含有光合作用暗反應(yīng)所需的酶系統(tǒng)，光合片層受損，意味著光合作用酶系統(tǒng)受到影響，能量轉(zhuǎn)化無法順暢完成，導(dǎo)致細(xì)胞生長受到影響，從而必定會(huì)影響藻的運(yùn)動(dòng)。

通過多次試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，在09：00—10：00期間，Nitzschia amplectens 最活躍，因此將試驗(yàn)情況觀察時(shí)間定在這一時(shí)段。Cd2+濃度為4.989、2.495 mg/L時(shí)，所有藻停止運(yùn)動(dòng)，因此Cd2+濃度最高點(diǎn)設(shè)定在2.495 mg/L。通過觀測運(yùn)動(dòng)情況發(fā)現(xiàn)，Cd2+對Nitzschia amplectens運(yùn)動(dòng)速度有很大的影響，可能是胞外蛋白聚糖（EPS）與硅藻運(yùn)動(dòng)有關(guān)[17-18]。今后可以深入開展Nitzschia amplectens胞外產(chǎn)物與運(yùn)動(dòng)情況相關(guān)的試驗(yàn)。

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