李芳

摘要：本研究通過(guò)基于DNA條形碼的分子鑒定方法對(duì)廣東省廣州市白云山風(fēng)景區(qū)一株馬勃菌進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定。以野外采集的子實(shí)體提取的基因組為模板，擴(kuò)增ITS和EF1α片段，并進(jìn)行測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析。獲得了600 bp左右的ITS片段和500 bp左右的EF1α片段，經(jīng)分子系統(tǒng)學(xué)分析表明該硬皮馬勃菌為Scleroderma sinnamariense，從而對(duì)該真菌進(jìn)行了基于DNA條形碼的精準(zhǔn)鑒定。

關(guān)鍵詞：硬皮馬勃菌；分子鑒定；DNA條形碼；ITS；EF1α

中圖分類號(hào)：S939.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）11-2598-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.010

Identification of One Scleroderma sp. Strain Based on DNA Barcoding

LI Fang

（Department of Chemical Engineering， Binzhou University， Binzhou 256600， Shandong， China）

Abstract： The aim of this study is to identify a Scleroderma sp. using DNA barcoding. ITS and EF1α genes were PCR amplified and sequenced. Further，molecular phylogeny based on ITS and EF1α confirmed the genetic position of this fungus. About 600 bp of ITS fragment and about 500 bp of EF1α fragments were obtained. The molecular phylogenetic analysis indicated that the fungus was Scleroderma sinnamariense. The results provided an exact identification method for this macro-fungus by DNA barcoding.

Key words： Scleroderma； molecular identification； DNA barcoding； ITS； EF1α

硬皮馬勃屬真菌，廣泛分布于世界各地，共有60余種，在中國(guó)較常見(jiàn)的有11種[1]。該屬真菌含有甾體化合物、萜類化合物、小分子含氮化合物、多糖、蛋白質(zhì)、肽類、生物堿以及多種氨基酸，無(wú)機(jī)鹽和微量元素等，具有一定的藥理作用和臨床應(yīng)用價(jià)值：抑菌、抗炎、止血、殺蟲(chóng)、抗腫瘤細(xì)胞等功效[2]。

DNA條形碼（DNA barcoding）是一種基于DNA序列差異，快速、準(zhǔn)確的物種鑒定方法[3]。目前硬皮馬勃屬真菌的鑒定主要依賴于形態(tài)學(xué)的鑒定，部分研究利用ITS對(duì)野外生境采集的子實(shí)體進(jìn)行分子水平鑒定[4]。因此選取ITS、EF1α兩個(gè)序列對(duì)從廣東省廣州市白云山風(fēng)景區(qū)采集的一株硬皮馬勃菌進(jìn)行序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析，并對(duì)該屬適合的DNA barcoding進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試硬皮馬勃菌子實(shí)體于2013年5月采自廣東省廣州市白云山風(fēng)景區(qū)，子實(shí)體標(biāo)本編號(hào)為JZBHM008。

1.1.2 試劑 基因組DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit和凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit購(gòu)自德國(guó)QIAgen公司；TaKaRa PCR Mix購(gòu)自大連寶生物公司；瓊脂糖和SYBR Safe DNA Gel Stain購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 無(wú)菌解剖刀切除子實(shí)體表層，取內(nèi)部少量組織于1.5 mL的離心管中，加入少量液氮，研磨棒研磨至粉末狀后，利用Dneasy Plant mini Kit試劑盒（QIAgen，貨號(hào)69104）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA的提取。

1.2.2 ITS-PCR擴(kuò)增 選取ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物[5]，以所提基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃ 5 min（預(yù)變性）；95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min；降至4 ℃結(jié)束。反應(yīng)體系為50 μL。然后進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 EF1α-PCR擴(kuò)增 選取EF595F（5′-CCGATCTTGTAGACGTCCTG-3′）/EF1160R（5′-CGTGACTTCATCAAGAACATG -3′）[6]為引物，以所提基因組DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95 ℃ 5 min（預(yù)變性）；95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；降至4 ℃結(jié)束。反應(yīng)體系為50 μL。然后進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序 將目的條帶從瓊脂糖凝膠上切出后利用Qiagen Gel extraction kit純化后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司Bigdye法測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)DNAMAN5.2.9和Chromas Pro軟件進(jìn)行堿基修正與拼接，最終獲得的ITS和EF1α序列提交到GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。endprint

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 擴(kuò)增獲得的序列經(jīng)過(guò)NCBI網(wǎng)站BLAST比對(duì)后，選取近緣物種的ITS序列，利用MAGA6.0軟件包[7]中MUSCLE工具進(jìn)行比對(duì)，采用Kimura2-parameter模型[8]計(jì)算遺傳距離，采用Neighbour-Joining方法[9]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，重復(fù)抽樣1 000次分析系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各分支的支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以子實(shí)體內(nèi)部組織塊為材料提取的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得600 bp左右的ITS片段和500 bp左右的EF1α片段（圖1）。

2.2 序列測(cè)定

ITS和EF1α PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)Chromas Pro軟件進(jìn)行堿基修正，修正后的序列經(jīng)過(guò)DNAMAN5.2.9軟件進(jìn)行拼接，獲得565 bp的ITS序列和537 bp的EF1α序列，GenBank登錄號(hào)分別為KM048204和KM048205。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將本研究獲得ITS序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，選取近緣物種的ITS序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，Scleroderma sp. JZBHM008與S. sinnamariense CMU53-210-2和 S. sinnamariense SINSCL9的親緣關(guān)系最近，同源性為100%（支持率為100%），說(shuō)明本研究的菌株可能為S. sinnamariense。

EF1α系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，Scleroderma sp. JZBHM008與Scleroderma sp. JZBHM008與S. sinnamariense AWW254有92.8%的同源性（支持率為100%），與ITS的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了JZBHM008為S. sinnamariense（圖3）。

3 討論

EF1α基因是編碼延伸因子，能夠與核糖體循環(huán)結(jié)合而把氨基酸加到多肽鏈上的蛋白質(zhì)因子。EF1α基因是帶有內(nèi)含子的單拷貝基因[10]，一般第一、二密碼子高度保守，但第三密碼子替換常常達(dá)到飽和，因此是一個(gè)具有潛力的標(biāo)記基因。本研究中EF1α的比對(duì)分析結(jié)果表明，僅含有197個(gè)可變位點(diǎn)和106個(gè)簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)（對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)有貢獻(xiàn)的位點(diǎn)），而ITS序列包含287個(gè)可變位點(diǎn)和148個(gè)簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)，具有更多的菌株差異，在分類鑒定中有更好的分辨率，因此ITS較EF1α更為適合作為Scleroderma屬的核心DNA barcoding，EF1α可以作為輔助。

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