郭咪咪 梅書棋 喬木 吳俊靜 趙康 程堯 李助南

摘要：為鑒定與豬的肉質(zhì)性狀有重要影響的分子標(biāo)記，經(jīng)克隆測序，鑒定出OLR1基因第5內(nèi)含子存在C52T突變，通過PCR-PstⅠ-RFLP方法進(jìn)行了基因型檢測，分別計算了該SNP在大白豬、長白豬、梅山豬、大白×梅山F2代豬中的基因型頻率和基因頻率，并且對大白×梅山F2代豬的基因型與肉質(zhì)相關(guān)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，CC基因型的肩部膘厚、胸腰椎間膘厚、平均背膘極顯著高于CT基因型個體（P<0.01）；CC基因型的皮率、瘦肉率、6-7腰椎間膘厚、花油重、臀部膘厚、背最長肌大理石紋、股二頭肌大理石紋顯著高于CT基因型（P<0.05），C等位基因?qū)ωi的脂肪沉積具有正效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：豬；OLR1；PCR-PstⅠ-RFLP；肉質(zhì)性狀；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號：S828 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2686-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.034

Association Analysis on Meat Quality Traits and Polymorphism in Porcine OLR1 Gene

GUO Mi-mi1，MEI Shu-qi2，QIAO-Mu2，WU Jun-jing2，ZHAO Kang2，CHENG Yao1，LI Zhu-nan1

（1. College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China；

2.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 430064， China）

Abstract： To identify DNA markers which have significant effect on pig meat quality traits， the single nucleotide polymorphism （SNP） and genotype were tested by sequencing and PCR-PstⅠ-RFLP method，respectively. The results showed that a SNP （C52T） was found in intron 5，then the gene and genotype frequency in the Large White， Landrace， Meishan，Large White×Meishan F2s populations and the association analysis was performed in Large White×Meishan F2s pigs were analyzed. The results showed that the fat thickness， thorax-waist fat thickness and average backfat thickness of CC genotype pigs were extremely significantly higher than that of CT genotype（P<0.01）； CC genotype pigs had significant higher skin percentage， lean meat percentage，6-7 rib fat thickness，dressing percentage， hip fat thickness， meat marbling of longissimus dorsi and meat marbling of biceps femoris than that of CT genotype（P<0.05）. The results also showed that C allele had positive effect on fat deposition of pigs.

Key words： pig； OLR1； PCR-PstⅠ-RFLP； meat quality traits； association analysis

OLR1基因是動脈粥樣硬化的候選基因，主要氧化低密度脂蛋白（OxLDL）內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化病變和參與一些細(xì)胞過程，影響動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制[1]。OLR1基因?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞的損傷、參與動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[2，3]。

目前關(guān)于OLR1基因的研究主要集中在對人的心血管疾病和奶牛的產(chǎn)奶性狀方面[4-6]。Liu等[7]對3′-UTR C188T和G501C多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，G501C突變位點(diǎn)的SNP對腦梗塞有顯著影響，3′-UTR處的SNP C188T對腦梗塞無顯著影響。Khatib等[8]在OLR1基因上發(fā)現(xiàn)8個單核苷酸多態(tài)性，其中第4外顯子上有2個SNP；第4內(nèi)含子有5個SNP；3′-UTR有1個SNP，3′-UTR的g.8232的SNP多態(tài)性可能控制奶牛的乳脂量和乳脂率，該突變位點(diǎn)也影響OLR1 mRNA的翻譯及穩(wěn)定性。Schennink等[9]對OLR1基因g.8232 C/A突變位點(diǎn)與荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)對奶牛乳脂率有顯著影響（P<0.05）。李托等[10]對秦川牛OLR1基因g.10497 C/A多態(tài)性與肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)對秦川牛眼肌面積和眼肌深度有顯著性影響。豬的OLR1基因位于豬5號染色體上。目前，關(guān)于豬的OLR1基因的報道較少，國內(nèi)外還未對該基因多態(tài)性與豬的生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。本試驗(yàn)對4種不同品種豬的OLR1基因基因型進(jìn)行檢測，并對大白×梅山F2代豬的胴體性狀和肉質(zhì)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，尋找影響豬肉性狀的分子標(biāo)記，為豬的優(yōu)良育種提供理論依據(jù)，以推動豬肉品質(zhì)改良的育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

大白豬、長白豬、梅山豬、大白×梅山F2代豬均來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)良育種豬場。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：組織細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購自艾德萊生物公司、2×Taq Master Mix購自Yeastern Biotech公司、DL 2000 DNA Marker 購自TaKaRa生物公司、PstⅠ限制性內(nèi)切酶購自湖北晶茂生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：超微量分光光度計Photometer（北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司）、DNA Engine PCR儀、DYY-6B電泳儀（北京市六一儀器廠）、LRH-250F生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-rad伯樂公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與豬群性狀測定 采集試驗(yàn)豬的耳組織約0.5 g，剪碎后按照DNA提取試劑盒（艾德萊生物公司）說明提取基因組DNA，用超微量分光光度計測定其濃度及OD值，將提取后的DNA置于-20 ℃保存。

試驗(yàn)豬群的性狀測定包括活體性狀測定，體重達(dá)100 kg左右時，集中屠宰測定胴體性狀、肉質(zhì)性狀和其他性狀。測定方法根據(jù)《種豬測定原理與方法》進(jìn)行[11]。

1.3.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的豬DNA序列（GenBank登錄號為CU856657.3），篩查SNP位點(diǎn)，設(shè)計引物P1擴(kuò)增第4、5內(nèi)含子序列；設(shè)計引物P2，進(jìn)行PCR-RFLP分型，引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列及PCR條件見表1。

1.3.3 PCR擴(kuò)增測序，篩查SNP 用引物P1分別對5頭梅山豬和5頭大白豬的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下：2.0 μL DNA混合液模板，上下游引物各1.5 μL （10 μmol/L），25.0 μL 2×Taq Master Mix，加去離子水至50 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行雙向序列測定，利用Chromas軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.4 PCR-PstⅠ-RFLP分析 用引物P2，PCR擴(kuò)增體系如下：1.0 μL DNA模板，上下游引物各1.0 μL （10 μmol/L），12.5 μL 2×Taq Master Mix，加去離子水至總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

酶切體系：取5.5 μL PCR產(chǎn)物，加入PstⅠ內(nèi)切酶0.5 μL （10 U/μL），1 μL 10×Buffer（含10×BSA），加去離子水至總體積10 μL，在37 ℃溫育過夜，用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，成像系統(tǒng)觀察并記錄酶切結(jié)果。

1.3.5 統(tǒng)計分析 OLR1基因及基因型頻率計算方法參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，設(shè)等位基因C、T的頻率分別為p和q，則：

p=（2n1+n2）/2N

q=（2n3+n2）/2N

式中，n1為CC型個體數(shù)，n2為CT型個體數(shù)，n3為TT型個體數(shù)，N為總個體數(shù)。

基因型頻率=某一基因型個體數(shù)/所測個體總數(shù)

應(yīng)用模型對242頭大白×梅山F2代豬OLR1基因PCR-PstⅠ-RFLP不同基因型與豬生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所分析的性狀主要為胴體性狀和肉質(zhì)性狀。

根據(jù)Liu[13]所述方法建立單標(biāo)記回歸統(tǒng)計模型，采用SAS統(tǒng)計軟件（SAS Institute Inc，Version 8.0）的GLM過程進(jìn)行單標(biāo)記方差的統(tǒng)計分析，同時采用REG程序?qū)蚣有孕?yīng)和顯性效應(yīng)進(jìn)行計算，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，所采用模型為：

Yijkl=？滋+Gi+Fj+Sk+Yl+bijklXijkl+eijkl

式中，Yijkl為性狀表型值，？滋為平均值，Gi為基因型效應(yīng)；Sk、Yl、Fj為固定效應(yīng)，分別為性別、年度、家系效應(yīng)，bijkl為屠宰體重或屠宰日齡的回歸系數(shù)，胴體性狀以屠宰體重為協(xié)變量，肉質(zhì)性狀以屠宰日齡為協(xié)變量，eijkl為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬OLR1基因的SNP研究

將獲得的5頭梅山豬和5頭大白豬OLR1基因測序結(jié)果，用軟件Chromas進(jìn)行序列分析，分析表明，位點(diǎn)第5內(nèi)含子的C52T突變，測序圖中雙峰處即為C/T突變，測序圖譜如圖1所示。

2.2 豬OLR1基因在不同群體中PCR-PstⅠ-RFLP基因型分析

分析發(fā)現(xiàn)，該SNP位點(diǎn)會被PstⅠ（CTGCA^G）限制性內(nèi)切酶識別，針對該處突變位點(diǎn)設(shè)計了表 1所示的引物 P2進(jìn)行PCR-PstⅠ-RFLP多態(tài)基因型分析。PCR產(chǎn)物長度為583 bp，當(dāng)?shù)?內(nèi)含子的 C52T位點(diǎn)為C時，不能被PstⅠ酶切，酶切后只有一個片段，長度為583 bp（C等位基因）；當(dāng)該位點(diǎn)為T時，PstⅠ酶切后產(chǎn)生兩個片段，長度分別為172 bp和 411 bp（T等位基因）。豬OLR1基因的PCR-PstⅠ-RFLP酶切分型結(jié)果如圖2所示。

利用PCR-PstⅠ-RFLP方法，對大白豬、長白豬、梅山豬和大白×梅山F2代豬群體進(jìn)行基因分型。如表2所示，在長白豬群體中C等位基因的頻率等于T等位基因的頻率，大白、梅山和大白×梅山豬群體中C等位基因的頻率高于T等位基因的頻率，尤其是梅山豬群體中C等位基因的頻率高達(dá)1.00，等位基因C在群體中明顯占優(yōu)勢。

2.3 豬OLR1基因的PCR-PstⅠ-RFLP基因型與生產(chǎn)性狀的統(tǒng)計分析

對豬OLR1基因PCR-PstⅠ-RFLP不同基因型與豬生產(chǎn)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，用于統(tǒng)計分析的試驗(yàn)材料為242頭大白×梅山F2代豬，所分析的性狀主要為胴體性狀和肉質(zhì)性狀。PCR-PstⅠ-RFLP基因型檢測結(jié)果表明，在所檢測的242頭試驗(yàn)豬群體中，CC基因型159頭，CT基因型83頭，TT基因型0頭。不同基因型與生產(chǎn)性狀間的統(tǒng)計分析結(jié)果總結(jié)于表3。用SAS統(tǒng)計軟件的GLM和REG程序，對242頭大白×梅山F2代豬個體基因型與生產(chǎn)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，由表3可知，豬OLR1基因多態(tài)性與肩部膘厚、胸腰椎間膘厚、平均背膘極顯著相關(guān)（P<0.01）；與皮率、瘦肉率、6-7腰椎間膘厚、花油重、臀部膘厚、背最長肌大理石紋、股二頭肌大理石紋顯著相關(guān)（P<0.05）?；蛐?yīng)方面花油重顯性效應(yīng)達(dá)到極顯著水平（P<0.01）；6-7腰椎間膘厚、臀部膘厚的加性效應(yīng)和內(nèi)脂率、背最長肌肌肉色值、股二頭肌肌肉色值的顯性效應(yīng)達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

3 討論

豬的肉質(zhì)性狀屬多基因控制的數(shù)量性狀，由一系列主基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative trait locus，QTLs）決定[14]。分子標(biāo)記輔助選擇在豬的選育方面起著重要的作用，促進(jìn)了研究者利用相關(guān)的分子標(biāo)記對豬的胴體及肉質(zhì)性狀進(jìn)行有效的選育，推動了豬肉質(zhì)改良的育種進(jìn)程。

對于該位點(diǎn)在不同品種豬群中的多態(tài)性分析，在長白豬群體中C等位基因頻率與T等位基因頻率相等，在大白豬、梅山豬和大白×梅山F2代豬群體中均是C等位基因高于T等位基因，尤其是脂肪型梅山豬群中C等位基因頻率高達(dá)1.00，該結(jié)果表明C等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因，且C等位基因?qū)ωi的脂肪沉積具有正效應(yīng)。在對4種不同豬群體的PCR-PstⅠ-RFLP分析中，均未檢測到TT基因型的存在，這可能與T等位基因在4種豬群體中含量少或者試驗(yàn)的樣本量較少有關(guān)。

通過對豬OLR1基因PCR-PstⅠ-RFLP基因型與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)CT基因型比CC基因型具有更高的瘦肉率，差異顯著（P<0.05）；胴體性狀的肩部膘厚、6-7腰椎間膘厚、胸腰椎間膘厚、花油重、臀部膘厚、平均背膘CC基因型比CT基因型高；肉質(zhì)性狀中的背最長肌大理石紋、股二頭肌大理石紋CC基因型比CT基因型高，以上結(jié)果表明OLR1基因在豬的脂肪沉積方面具有積極的調(diào)控作用，其中CC基因型的個體具有更強(qiáng)的脂肪沉積能力。本研究發(fā)現(xiàn)該SNP位點(diǎn)是與豬脂肪沉積相關(guān)的分子標(biāo)記，為標(biāo)記輔助選擇奠定了基礎(chǔ)，由于豬脂肪生長發(fā)育是一個復(fù)雜的生理生化過程，受多種基因調(diào)控[15]，其具體的作用機(jī)理及遺傳機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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