劉 濤，羅小偉，梁 悅，王 鴻，焦 芳，伍月，張 敏，趙 群，徐玉玲

(成都大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

0 引 言

丹參為唇形科植物丹參的干燥根及根莖，是中藥中應(yīng)用最早、最廣泛的藥物之一，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》.丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消痛之功效［1］，臨床常用于心血管疾病、急慢性肝炎、抗菌消炎等［2］.丹參中主要含脂溶性的二萜醌類和水溶性的酚酸類成分，其傳統(tǒng)用藥部位為根和根莖，棄去莖葉部分，但現(xiàn)代藥理試驗(yàn)已證明丹參莖葉的藥理作用與根、根莖相似，臨床療效類似［3－4］.丹參地上部分約占全株植物的67%［5］，藥源豐富，對(duì)其加以開發(fā)利用意義重大.

本研究選擇采收于四川中江縣的丹參莖葉為原藥材，參照《中國(guó)藥典》2010 版一部丹參項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)丹參莖葉質(zhì)量進(jìn)行了研究，擬為其質(zhì)量評(píng)價(jià)和使用提供依據(jù).

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括:P2302II 型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)，KQ-100 型超聲波清洗器，RE-5205B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀.

1.2 試 劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括:丹酚酸B 對(duì)照品(批號(hào)，111562－201212)，迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào)，111871－201404)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所;丹參莖葉(批號(hào)，20140703、20140813、20140914)，采自中江石泉鄉(xiāng);乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，均購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠.

2 方法與結(jié)果

2.1 性 狀

丹參植株性狀:其莖直立呈四棱形，具多級(jí)分枝，被長(zhǎng)柔毛;葉對(duì)生，為奇數(shù)羽狀復(fù)葉，葉片闊卵形或類圓形，邊緣有鋸齒;小葉3 或5，較小，長(zhǎng)3.3 ～6.5 cm，寬3 ～4.5 cm，總?cè)~柄長(zhǎng)4.5 ～11 cm;輪傘花序組成頂生或腋生的假總狀花序;花萼鐘狀，紫色;花冠藍(lán)紫色，唇形.

2.2 測(cè) 定

2.2.1 總灰分測(cè)定.

按照《中國(guó)藥典》2010 版［6］附錄IX K 項(xiàng)下總灰分測(cè)定法對(duì)丹參莖葉進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果分別為9.45%、8.63%，故規(guī)定其灰分限度不得超過(guò)7.22%.

2.2.2 酸不溶性灰分測(cè)定.

按照《中國(guó)藥典》2010 版［6］附錄IX K 項(xiàng)下酸不溶性灰分測(cè)定法對(duì)丹叁莖葉進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果分別為0.86%、0.82%，故規(guī)定其酸不溶性灰分限度不得超過(guò)0.67%.

2.2.3 浸出物測(cè)定.

按照《中國(guó)藥典》2010 版［6］附錄X A的水溶性浸出物(熱浸法)對(duì)丹參莖葉進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果分別為18.24%、18.13%，故規(guī)定其浸出物限度不得少于14.54%.

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備.

取丹酚酸B 對(duì)照品適量，加75%甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液.

2.3.2 供試品溶液的制備.

取丹參莖葉粉末(批號(hào)，20140703)0.2 g，加75%甲醇25 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液.

2.3.3 鑒別試驗(yàn).

按照薄層色譜法［6］進(jìn)行試驗(yàn).吸取上述2 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254 薄層板上，以甲苯∶ 三氯甲烷∶ 乙酸乙酯∶ 甲醇∶ 甲酸(2∶ 3∶ 4∶0.5∶ 2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(波長(zhǎng)254 nm)下檢視.供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，具體見圖1.

圖1 丹參莖葉TCL 圖

2.4 迷迭香酸、丹酚酸B 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件.

測(cè)定的色譜條件為:P230II(大連伊力特公司)，SinoChrom ODS-BP 色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相，甲醇∶ 乙腈∶ 甲酸∶ 水(30∶ 10∶ 1∶59)，流速1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為室溫.

2.4.2 對(duì)照品的制備.

分別取丹酚酸B、迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加75%甲醇分別制成每1 mL含丹酚酸B 0.1237 mg、迷迭香酸0.4792 mg 的對(duì)照品溶液;另取丹酚酸B、迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加75%甲醇制成每1 mL 含丹酚酸B 0.0634 mg、迷迭香酸0.0923 mg 的混合對(duì)照品溶液.

2.4.3 供試品制備條件的選擇.

在供試品制備時(shí)，本研究分別采用超聲和回流2 種方式進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)回流效果較好.同時(shí)還考察了以水、50%甲醇、75%甲醇為溶媒，溶媒用量為25、50 mL，回流時(shí)間為0.5、1、1.5 h 時(shí)對(duì)丹參莖葉中迷迭香酸、丹酚酸B 含量的影響.最終確定，當(dāng)溶媒為75%甲醇，用量為50 mL，回流1 h 時(shí)制備出的丹參莖葉供試品中迷迭香酸、丹酚酸B 含量最高，這與《中國(guó)藥典》2010 版［6］丹參項(xiàng)下含量測(cè)定結(jié)果一致.

2.4.4 供試品的制備.

取丹參莖葉粉末(過(guò)3 號(hào)篩)約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定，用75%甲醇補(bǔ)足減失的液體，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，制得供試品溶液.

2.4.5 線性關(guān)系考察.

精密吸取迷迭香酸、丹酚酸B 混合對(duì)照品溶液2、4、8、10、14、20 μL 分別進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，并以峰面積Y 對(duì)進(jìn)樣量X 進(jìn)行線性回歸得:

①迷迭香酸線性回歸方程，

y=181.44X－10.493，r=0.9999

②丹酚酸B 線性回歸方程，

y=59.180X+18.303，r=0.9993.

結(jié)果表明，迷迭香酸、丹酚酸B 分別在0.1846～1.18460 μg、0.1268 ～1.2680 μg 范圍內(nèi)與峰面積成良好線性關(guān)系.

2.4.6 精密度實(shí)驗(yàn).

精密吸取迷迭香酸、丹酚酸B 混合對(duì)照品溶液10 μL，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積.結(jié)果顯示，迷迭香酸、丹酚酸B 峰面積RSD 分別為0.7991%和1.5413%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法精密度較好.

2.4.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn).

精密吸取“2.4.4”項(xiàng)下方法制備好的供試品溶液10 μL，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、1、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積.結(jié)果顯示，迷迭香酸、丹 酚 酸 B 峰 面 積 RSD 分 別 為 0.5057% 和1.9486%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液8 h 內(nèi)穩(wěn)定.

2.4.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn).

按照“2.4.4”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液.按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定迷迭香酸、丹酚酸B 峰面積RSD 分別為0.7538%和1.9321%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液重復(fù)性良好.

2.4.9 回收率實(shí)驗(yàn).

取已知含量的丹參莖葉粉末樣品6 份(過(guò)3 號(hào)篩)，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，在6份樣品中平行加入精密移取迷迭香酸對(duì)照品4 mL，丹酚酸B 對(duì)照品2.3 mL，按照“2.4.4”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其含量，計(jì)算加樣回收率(見表1).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法回收率良好.

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4.10 樣品測(cè)定.

分別取7、8、9 三個(gè)月份的丹參莖葉粉末(過(guò)3號(hào)篩)每份約2.0 g，按照“2.4.4”項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液.按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其含量，結(jié)果如表2、圖2 所示.

表2 丹參莖葉中迷迭香酸和丹酚酸B 的含量的測(cè)定結(jié)果

圖2 丹參莖葉HPLC 圖譜

3 討 論

丹參主要分布于四川、陜西、河南等地.丹參植株采收后，莖葉通常被丟棄.研究發(fā)現(xiàn)，丹參莖葉中含有大量的迷迭香酸、丹酚酸B 等藥用成分［7－10］，恰當(dāng)?shù)亻_發(fā)利用丹參莖葉，對(duì)于合理利用丹參植株以及保護(hù)環(huán)境和節(jié)約資源都有一定的意義.本研究建立了丹參莖葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有利于對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)質(zhì)量控制，為其合理利用提供質(zhì)量保證.

在研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，丹參莖葉中含有丹酚酸B，同時(shí)迷迭香酸的含量較高，而相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)同時(shí)測(cè)定丹參莖葉中迷迭香酸和丹酚酸B 的含量報(bào)道較少，對(duì)此，本研究建立了相關(guān)測(cè)定方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，色譜條件重復(fù)性良好，主要成分峰的分離度良好，專屬性強(qiáng)，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，符合相關(guān)技術(shù)要求.需說(shuō)明的是，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同月份丹參莖葉均含有迷迭香酸和丹酚酸B，但含量具有顯著性差異，對(duì)此，本研究將做進(jìn)一步研究.

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