羅 霄，代 琪，曾 楨，汪 丹

(1.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 6101061;2.成都大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與護(hù)理學(xué)院，四川 成都 610106;3.四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

0 引 言

脂必妥片收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-11524(ZD-1524)-2002-2013Z，由紅曲單味藥制備而成，具有健脾消食、除濕祛痰、活血化瘀的功效，常用于脾瘀阻滯、癥見氣短及高血脂癥等疾病的輔助治療.由于紅曲制備過程中易產(chǎn)生黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)，該毒素是黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物，普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中，長(zhǎng)期攝入對(duì)人體會(huì)造成極大傷害［1－2］.黃曲霉毒素主要有4 種，G1、G2、B1、B2，其中B1 被認(rèn)為是主要的有毒物質(zhì)［3］.研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素B1(AFT B1)含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?香豆素)，前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān)［4］.鑒于AFT B1 對(duì)人體的危害，建立AFT B1 高效定量的檢測(cè)方法已成為研究重點(diǎn).對(duì)此，本研究采用有機(jī)溶劑提取、免疫親和柱(IAC)凈化分離和柱后碘衍生—高效液相色譜法，建立了AFT B1 的含量測(cè)定方法，擬為該制劑的安全保證提高提供科學(xué)依據(jù).

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括:Waters2998 高效液相色譜儀，熒光檢測(cè)器，AE-240 電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)，AUX-220 電子天平(日本島津儀器公司)，SK250H 超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)，TGL-16G 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠).

1.2 試藥與試劑

實(shí)驗(yàn)所用試藥與試劑包括:AFT B1(批號(hào)，Pribolab STD#1041 1200823，25 μg/mL);玻璃濾紙為WhatmanTM(Diameter 110 mm);流動(dòng)相中的甲醇和乙腈為色譜純(德國(guó)LiChrosolv);水為超純水，其余試劑均為分析純;脂必妥片(批號(hào)，S120904、S120905、S120906)由成都地奧九鴻制藥廠提供.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇—乙腈—水(40∶ 18∶ 42)為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min;采用柱后衍生法檢測(cè)，衍生溶液為0.05%的碘溶液(取碘0.5 g，加入甲醇100 mL 使溶解，用水稀釋至1 000 mL 制成)，衍生化泵流速為0.3 mL/min，衍生化溫度70 ℃;以熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)λex 為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem 為450 nm.

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密量取AFT B1 對(duì)照品(25 μg/mL)0.4 mL，置100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液.精密量取儲(chǔ)備液1 mL，置500 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得對(duì)照品溶液(每1 mL AFT B1 為0.2 ng).

2.3 供試品溶液的制備

取脂必妥片40 片，研細(xì)，精密稱取5.0 g，加入氯化鈉4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(250W，40 kHz)20 min，放冷后再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，離心3 min(5 000r/min)，精密量取上清液5 mL，置25 mL 量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用玻璃纖維濾紙濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，通過免疫親和柱(AflaT-est@P)，流速為3 mL/min，用10%甲醇溶液洗滌燒杯和針筒等，將洗液過柱，再用水10 mL洗脫(流速為4.0 mL/min)，棄去洗脫液，吹氣除去柱中水滴，再用1.5 mL 甲醇，以每秒1 滴的速度洗脫，收集洗脫液，置2 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得供試品溶液.

2.4 檢出限測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下AFT B1 對(duì)照品溶液1 mL 至10 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL AFT B1 為0.02 ng，進(jìn)樣4 μL，計(jì)算信噪比與進(jìn)樣濃度，測(cè)得其檢出限為，0.5 μg/kg.

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取AFT B1 對(duì)照品溶液，分別依次進(jìn)樣4、8、10、12、16、20 μL，測(cè)定色譜峰面積.將AFT B1 的色譜峰面積(Y)與進(jìn)樣量(X)回歸，其回歸方程為，

Y=5.6481 ×107X－8.2347 ×103，r=0.9999

故方法的線性范圍為，0.0008 ng ～0.004 ng.

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取AFT B1 對(duì)照品溶液(0.2 ng·mL－1)10.0 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算儀器精密度，其RSD 為0.80%.

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)(S120904)的脂必妥片供試品6 份，按“2.3”項(xiàng)下供試品的制備方法平行操作，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，其RSD 為1.05%.

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液(0.2 ng·mL－1)于0、2、6、8、10、12 h 分別進(jìn)樣10.0 μL，記錄峰面積，其RSD 為0.94%.

2.9 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量(0.6 ng·g－1)的脂必妥片，約2.5 g，按1∶ 1 的比例分別加入一定量的AFT B1對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，依法測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1.

表1 回收率的測(cè)定結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，從隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出含量，結(jié)果見表2.

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討 論

3.1 提取溶劑

AFT B1 易溶于帶極性的溶劑而不溶于非極性溶劑中，一般采用幾種有機(jī)溶劑中加入少量水可以增強(qiáng)有機(jī)溶劑對(duì)樣品的滲透力.實(shí)驗(yàn)比較了甲醇—水、乙腈—水、丙酮—水和三氯甲烷等幾種溶劑，均得到較高的回收率，其中以甲醇—水(80∶ 20)和丙酮—水(85∶ 15)提取效果最好，考慮到甲醇—水的適應(yīng)性更廣，選擇前者作為樣品的提取溶劑.

3.2 提取溶劑與樣品量比例

實(shí)驗(yàn)比較了溶劑量/樣品量分別為4∶ 1、8∶ 1 和10∶ 1，結(jié)果顯示，溶劑量/樣品量為10∶ 1 提取效率最高，樣品干擾雜質(zhì)最少，可以基本達(dá)到提取完全.

3.3 樣品凈化除雜

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品過柱時(shí)，流速對(duì)回收率結(jié)果影響較大，經(jīng)比較樣品過柱流速為3.0 mL/min，水洗滌柱子流速為4.0 mL/min，能滿足回收率測(cè)定要求;另樣品液過柱后再用10%甲醇溶液洗滌燒杯和針筒等，將洗液一并過柱，能提高測(cè)定結(jié)果.

3.4 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)過程盡量避免日光照射.樣品溶液采用玻璃纖維濾紙濾過.經(jīng)過水洗滌后的柱子，甲醇洗脫前，柱子中水滴的殘留對(duì)測(cè)定結(jié)果有較大影響.

［1］劉艷麗，程安春，汪銘書.黃曲霉毒素及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006，49(6):15－17.

［2］黃惠明，徐群英，胡敏.黃曲霉毒素檢測(cè)方法研究的概述［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2001，11(4):510－512.

［3］楊一剛.黃曲霉毒素B1 測(cè)定方法的探討［J］.科技情報(bào)開發(fā)與經(jīng)濟(jì)，2004，14(8):168－169.

［4］柳潔，何碧英.黃曲霉毒素高效液相色譜檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，7(15):891－896.