陶劍，潘興華，王金祥，楊建勇

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)衰老樹鼩模型代謝的影響

陶劍，潘興華，王金祥，楊建勇

目的通過(guò)D-半乳糖連續(xù)注射誘導(dǎo)樹鼩代謝紊亂建立衰老模型，評(píng)價(jià)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輸注對(duì)衰老樹鼩代謝的影響。方法12只雌性樹鼩分為空白組（2只）和模型組（10只），模型組每天頸背部皮下注射10%的D-半乳糖2.5ml/(100 g·d)，空白組皮下注射等體積注射用水，連續(xù)8 w后，檢測(cè)兩組外周血中超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH-PX)和丙二醛(MDA)的含量變化；建立衰老樹鼩模型后，經(jīng)尾靜脈輸注雄性樹鼩臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞2次，2 w后對(duì)樹鼩外周血中SOD、GSH-PX和MDA的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果連續(xù)注射D-半乳糖8 w后，模型組樹鼩體重下降，血漿SOD和GSH-PX的活性降低，MDA含量明顯升高(P＜0.05)。輸注樹鼩臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后，血清SOD和GSH-PX活性升高，MDA含量明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論連續(xù)注射D-半乳糖可誘導(dǎo)樹鼩出現(xiàn)衰老的特征性代謝改變，輸注樹鼩臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)衰老樹鼩的代謝具有改善作用。

D-半乳糖；衰老；樹鼩；臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞

衰老與機(jī)體的代謝障礙有密切關(guān)系，由D-半乳糖（D-galactose，D-gal）誘導(dǎo)加速的嚙齒類衰老模型動(dòng)物，建立方法是給動(dòng)物連續(xù)注射大劑量D-gal，其進(jìn)入細(xì)胞后不能被徹底代謝，引起細(xì)胞代謝紊亂，產(chǎn)生過(guò)量的超氧陰離子自由基損害細(xì)胞，可引起機(jī)體的衰老，這種D-gal超負(fù)荷造成的衰老模型，其各種生理、生化指標(biāo)變化均與自然衰老類似[1]。

樹鼩是小型哺乳類動(dòng)物，其與靈長(zhǎng)類動(dòng)物有較近的親緣關(guān)系[2]。我們利用樹鼩作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行抗衰老新型動(dòng)物模型的研究。通過(guò)觀察樹鼩連續(xù)注射D-gal后，其血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）和丙二醛(MDA)等氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，評(píng)價(jià)樹鼩作為衰老動(dòng)物模型的可行性；并觀察樹鼩臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)輸注干預(yù)后，樹鼩上述代謝指標(biāo)的變化，評(píng)價(jià)補(bǔ)充MSC對(duì)衰老動(dòng)物代謝的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞培養(yǎng)液DF12購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，D-gal購(gòu)自Sigma公司，SOD測(cè)試盒、GSH-PX測(cè)試盒和MDA測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2衰老模型的建立雌性樹鼩購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，健康，1.5歲齡，體重(150±20)g；隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組：模型組10只，每天頸背部皮下注射10%的D-gal 2.5ml/(100 g·d)，連續(xù)8 w[2]，建立衰老樹鼩模型?？瞻捉M2只，皮下注射等體積注射用水。

1.3 MSC的分離和培養(yǎng)[3-4]懷孕25~30 d的樹鼩購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。脫頸處死，無(wú)菌條件下分離樹鼩臍帶，剪碎、收集細(xì)胞懸液，離心，用干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，將6×104個(gè)有核細(xì)胞接種到T 25 cm的塑料培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，原代細(xì)胞接種24 h后，除去未貼壁的細(xì)胞，用D-Hank液換洗，換液；當(dāng)形成一些較大的細(xì)胞克隆時(shí)，用D-Hank液將培養(yǎng)的細(xì)胞洗2遍，加入0.25%胰酶(含0.01%EDTA)消化液，室溫消化2 min，用牛血清終止胰蛋白酶的作用，取部分細(xì)胞做雄性特異性Sry基因鑒定。

1.4 雄性特異性Sry基因檢測(cè)PCR引物：Sry上游:5'-CAG CTA ACA CTG ATC TTT TC-3'，下游：5'-TTA CTG AGC CAG AAT CAT AG-3'；β-actin上游：5'-TGT ACG TAG CCA TCC AGG C-3'，下游：5'-TTC TCC AGG GAG GAA GAG GA-3'，由大連寶生物公司合成。PCR反應(yīng)條件如下：94℃孵育3min；35個(gè)循環(huán)(94℃30 s，50℃30 s，72℃2.5 min)，最后在72℃延伸5min。

1.5 樹鼩臍帶MSC輸注給D-gal連續(xù)注射誘導(dǎo)衰老成功的雌性樹鼩，尾靜脈輸注雄性臍帶MSC的單細(xì)胞懸液，106個(gè)細(xì)胞/只，1次/2 w，共2次。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)分別在注射D-gal前和注射后第9 w時(shí)，通過(guò)尾靜脈采集外周血3 ml，室溫下放置4 h后，離心，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆?，分別檢測(cè)下述指標(biāo)，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.6.1 SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法，用752紫外分光度計(jì)550 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，根據(jù)抑制率的高低計(jì)算SOD的含量。

1.6.2 MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，用752紫外分光度計(jì)532 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。

1.6.3 GSH-PX活性采用化學(xué)比色法，用752紫外分光度計(jì)在412 nm處檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D-gal誘導(dǎo)樹鼩出現(xiàn)衰老特征的代謝改變連續(xù)8 w給樹鼩皮下注射D-gal后，樹鼩表現(xiàn)為：體重減少，血清中SOD及GSH-PX活性下降，而MDA含量升高(P＜0.05，表1）。

2.2 臍帶MSC輸注干預(yù)后樹鼩代謝障礙得到改善

D-gal誘導(dǎo)衰老樹鼩輸注臍帶MSC 6 w后，體重逐漸上升，血清SOD及GSH-PX活性逐漸恢復(fù)，而MDA含量降低(P＜0.05，表1）。取MSC處理后的樹鼩肝組織，提取核酸，PCR擴(kuò)增Syr基因，瓊脂糖電泳，可見明顯的條帶，證明有來(lái)自雄性供體的細(xì)胞。

3 討論

血液中的SOD和GSH-PX活性隨動(dòng)物年齡的增長(zhǎng)而降低，它們是反映機(jī)體衰老和氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)。本研究通過(guò)給青年樹鼩連續(xù)注射D-gal，8 w后，實(shí)驗(yàn)樹鼩出現(xiàn)體重減少，血漿SOD及GSH-PX活性下降，MDA含量升高，動(dòng)物表現(xiàn)出機(jī)體抗氧化能力減弱和代謝紊亂的特征，與嚙齒類動(dòng)物衰老模型表現(xiàn)基本一致。給衰老樹鼩輸注MSC進(jìn)行干預(yù)6 w后，樹鼩血清SOD及GSH-PX活性得到逐漸恢復(fù)，而MDA則含量逐漸降低。提示適當(dāng)補(bǔ)充MSC，可對(duì)機(jī)體SOD和GSH-PX的活性產(chǎn)生影響，對(duì)衰老樹鼩的代謝具有改善作用。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（如獼猴和黑猩猩）具遺傳學(xué)上最接近人類的優(yōu)勢(shì)，用其建立的衰老模型在特征和發(fā)生機(jī)制方面能夠較全面地反映人類衰老基本情況，但是它們價(jià)格昂貴且不易獲取。樹鼩與靈長(zhǎng)類親緣關(guān)系最為接近，本研究結(jié)果表明，通過(guò)注射D-gal，可以誘導(dǎo)樹鼩發(fā)生衰老的代謝改變，我們認(rèn)為用其代替非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，具有可行性，在未來(lái)衰老和抗衰老的研究中，樹鼩衰老模型有著良好的應(yīng)用前景。

[1]張常娥，魏偉，劉英華,等.D-半乳糖亞急性衰老大鼠模型的建立及評(píng)價(jià)[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2012，32(4):742-745.

表1 D-gal誘導(dǎo)樹韻衰老和MCS干預(yù)后血槳SOD、GSH-PX活性和MDA含量的變化

[2]Fan Y,Huang ZY,Cao CC，et al.Genome of the Chinese tree shrew[J]，Nature Communications,2013,4，Article number:1426.

[3]Baksh D,Yao R,Tuan RS.Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of humanmesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow[J],Stem Cells，2007，25(6):1384-1392.

[4]Covas DT,Siufi JL,Silva AR,et al.Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells[J],Braz JMed Biol Res, 2003，36(9):1179-1183.

Effects of umbilical cordmesenchymal stem cells onmetabolism of aging tree shrewmodel

Tao Jian1,2,Pan Xinghua1,Wang Jinxiang1,Yang Jianyong11.Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province/Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;2.Medical School of Kunming University,Yunnan,Kunming,650214,China

Objective To establish the agingmodel throughmetabolic disorder of tree shrew induced by continuous injection with D-galactose,and to evaluate the effects of umbilical cord mesenchymal stem cell infusion on the metabolism of aging tree shrew.Methods Twelve female tree shrews were divided into blank group(two)and modeling group(ten).The modeling group

subcutaneous injection in the nape with 10%D-galactose 2.5ml/(100 g·d).The blank group received the subcutaneous injection with the same volume of water.After continuous 8 weeks,detection wasmade in the content changes of SOD,GSH-PX,and MDA in the peripheral blood of both groups.After the establishmentof aging tree shrewmodel,themale tree shrews received twice the intravenous injection via the tailswith umbilical cordmesenchymal stem cells.Twoweeks later,detection wasmade in the SOD,GSH-PX,and MDA contents in the peripheral blood.Results After injection with D-galactose for continuous 8 weeks,the weight ofmodeling tree shrews decreased.The activity ofblood plasma SOD and GSH-PX decreased,and the content of MDA significantly increased(P＜0.05).After the injection with umbilical cordmesenchymal stem cells,the tree shrews'serum SOD and GSH-PX activity increased,and the content ofMDA significantly decreased(P＜0.05).Conclusion Continuous injection with D-galactose can induce the distinctive agingmetabolic changes in tree shrews.The infusion with umbilical cordmesenchymal stem cells can improve themetabolism ofaging tree shrews.

D-galactose;aging;tree shrew;umbilical cord;mesenchymal stem cell

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0832-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.007

2015-03-26）

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2014BI01B0）；國(guó)家自然科學(xué)基金(31172170)；云南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院（陶劍,潘興華，王金祥，楊建勇）；昆明醫(yī)學(xué)院（陶劍）

潘興華，E-mail:xinghuapan@sohu.com.cn