黃敏剛 付瑞敏 谷亞楠 郭彥釗 陳五嶺

摘要：分別從新疆油田、大慶油田的原油中分離得到高效石油降解菌2株，分別編號(hào)L-1和D-2，對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)分析，而后將L-1和D-2等比例形成微生物復(fù)合菌劑，測(cè)定復(fù)合菌劑對(duì)不同濃度和不同性質(zhì)原油的降解率，并將該復(fù)合菌劑初步應(yīng)用于石油污水的處理中。經(jīng)鑒定，這兩株菌分別為多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivorum）和動(dòng)膠菌（Zoogloea oryzae）。復(fù)合菌劑的最適接種量為9%、最適處理時(shí)間為72 h、最適pH 7.5，在該條件下，可將污水的含油量降低85%。因此，這兩株高效石油降解菌在石油污水的處理中具有巨大的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：石油降解菌；原油；石油污水；水處理

中圖分類號(hào)：Q93-331；X741 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）13-3104-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.009

Screening on Highly Efficient Oil-degrading Bacteria and Their Application

in Oil Sewage Disposal

HUANG Min-gang1， FU Rui-min1，2， GU Ya-nan1， GUO Yan-zhao1， CHEN Wu-ling1

（1.College of Life Science， Northwest University， Xi'an 710069， China； 2.Henan Institute of Education， Zhengzhou 450046， China）

Abstract： Two strains（L-1，D-2），which can degrade petroleum， were isolated from crude oil of Xinjiang oilfield and Daqing oilfield respectively. After the morphological， physiological， biochemical and molecular analysis， the two strains were identified and mixed together in equal proportion to form the microbial agents. Then， the microbial degradation rates of crude oil with different concentration and properties were tested. After that， the microbial agents were preliminarily applied to crude oil sewage disposal. As was shown in the results， the strains（L-1，D-2）were identified as Sphingobacterium multivorum and zoogloea oryzae respectively. The optimal inoculating concentration of the microbial agents was 9%， the optimal processing time was 6 h， and optimal pH was 7.5.Under that condition， the removal rate of crude oil could reach 85%. Therefore， the two oil-degrading bacterium were considered to have great utilization potentials on oil sewage disposal.

Key words：oil-degrading bacteria； crude oil； oil sewage； water disposal

石油是由多種烴類組成的復(fù)雜混合物，含有少量硫、氮、氧等化學(xué)元素和微量金屬[1]。石油中的烴類化合物包括從甲烷到相對(duì)分子質(zhì)量1 500～2 000的烴類，主要包括烷烴、環(huán)烷烴及芳香烴，約占石油含量的50%～80%，其中烷烴是石油中的主要成分，碳原子數(shù)在1～40不等，其中以6～8個(gè)碳原子數(shù)的烷烴在石油中含量較高。目前，油井產(chǎn)物中的含水量遠(yuǎn)大于含油量，油田綜合含水率達(dá)90%以上[2]。石油污水的超標(biāo)排放對(duì)水體環(huán)境和自然生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害。石油污水中石油的存在形態(tài)分為4種：浮油、分散油、乳化油、溶解油。其中，浮油和分散油可以靜置一段時(shí)間從石油污水中分離出來，乳化油和溶解油可以穩(wěn)定分散于石油污水中，采用一般方法很難去除[3，4]。利用微生物分布廣、繁殖快以及可以徹底降解污染物和不產(chǎn)生二次污染來處理石油污水被視為一項(xiàng)應(yīng)用前景廣闊的石油污水處理技術(shù)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 原油樣品分別取自新疆油田和大慶油田的原油，原油的性質(zhì)見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：NaCl 10 g，NH4Cl 1.5 g，K2HP04 0.5 g，MgS04 0.5 g，CaCl2 0.2 g，KCl 0.1 g，F(xiàn)eS04·7H20 0.02 g，5 mL表面活性劑，去離子水1 000 mL，pH 7.0；

分離和斜面保存培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20～30 g，滅菌過的原油1%，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2；

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 10 g，NH4Cl 1.5 g，K2HP04 0.5 g，MgS04 0.5 g，CaCl2 0.02 g，KCl 0.1 g，F(xiàn)eS04·7H20 0.02 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0，滅菌過的原油酌情添加。

1.1.3 石油污水 石油污水取自某油田某采油廠，水質(zhì)如表2。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與篩選 分別將新疆油田和大慶油田滅菌過的10 g原油樣品加入到200 mL的富集培養(yǎng)基中，溫度35 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)7 d，通過稀釋涂平板法篩選分離出石油降解菌[6]。從大慶油田分離得到的菌株編號(hào)為D-1～D-6，從新疆油田分離得到的菌株編號(hào)為L(zhǎng)-1～L-7。

將分離得到的菌株制成菌懸液，取1 mL菌懸液接種到100 mL含石油濃度為4 g/L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度35 ℃，培養(yǎng)5 d之后采用GC分析法[7]測(cè)定培養(yǎng)液中的原油殘余量，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組為不接菌的原油濃度為4 g/L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，計(jì)算其平均降解率，篩選出高效降解菌株。

將篩選出的高效石油降解菌在LB平板上交叉劃線，檢驗(yàn)菌株間是否存在拮抗作用。

1.2.2 菌株形態(tài)觀察及生理生化反應(yīng) 將篩選所確定的菌株，在LB平板上劃線，32 ℃分別培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色觀察菌株的個(gè)體形態(tài)，觀察菌落形態(tài)，生理生化反應(yīng)[8]。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 參照前人方法[9]，采用上海生工提供的試劑盒提取所選菌株的DNA和回收其16S rDNA片段。16S rDNA的PCR擴(kuò)增引物采用通用引物（27F：5′-AGAGTTGTCATGGCTC-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），該引物合成自上海生工。PCR反應(yīng)參數(shù)（94 ℃，5 min； 94 ℃，50 s→50 ℃，50 s→72 ℃，90 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min）。由上海生工將所得PCR產(chǎn)物回收純化并對(duì)目的片段進(jìn)行基因測(cè)序，所得序列采用MEGA3.0同NCBI上的相近物種的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，樹的聚類穩(wěn)定性進(jìn)行1 000次自導(dǎo)檢驗(yàn)[10]。

1.2.4 石油降解菌對(duì)原油的降解試驗(yàn)

1）不同含油量對(duì)降解效果的影響。原油降解試驗(yàn)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基和原油樣品分開滅菌，改變液體發(fā)酵培養(yǎng)基中石油的添加量，使?jié)舛确謩e為1、2、4、6、8、10 g/L，菌劑接種量為5%，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行石油降解實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度35 ℃，培養(yǎng)5、10、15 d后分別取樣，分別采用GC分析法進(jìn)行殘余石油烴含量的分析及降解率的測(cè)定。

降解率=（m1-m2）/m1×100%，式中，m1為原油添加量，m2為原油殘余量。

2）原油性質(zhì)對(duì)降解效果的影響。原油降解試驗(yàn)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基和原油樣品分開滅菌，原油濃度為4 g/L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，混合菌劑接種量為5%，分為4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別為處理1（新疆原油+混合菌劑）、處理2（大慶原油+混合菌劑），大慶原油和新疆原油的處理組分別作為對(duì)照，轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度35 ℃，培養(yǎng)15 d后，采用GC分析法進(jìn)行殘余石油烴含量及降解率的測(cè)定。

1.2.5 復(fù)合菌劑對(duì)石油污水的處理試驗(yàn) 石油污水取自某油田采油廠，復(fù)合菌劑由L-1和D-2菌株以1∶1的比例組成，將復(fù)合菌劑接種到1 000 mL的石油污水中，選擇溫度為35 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，選擇復(fù)合菌劑的接種量、污水處理時(shí)間、石油污水的初始pH作為3個(gè)因素，選用L16（43）正交表，設(shè)計(jì)3因素4水平試驗(yàn)，以石油污水的原油降解率為試驗(yàn)指標(biāo)，確定最佳水處理試驗(yàn)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選和分類鑒定結(jié)果

從新疆油田和大慶油田的原油樣品中分別分離得到7和6株原油降解菌，編號(hào)為L(zhǎng)-1～L-7和D-1～D-6，其中有一株酵母菌，其余都是細(xì)菌，對(duì)每株菌進(jìn)行原油降解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)L-1和D-2的降解效率最高。每株石油降解菌的降解效果如表3。

通過L-1和D-2菌株在LB培養(yǎng)基上交叉劃線，從平板中兩株菌交叉點(diǎn)的生長(zhǎng)狀況來看，L-1和D-2菌株互相沒有拮抗作用，可以混合使用。

參照文獻(xiàn)[8]的步驟對(duì)L-1和D-2菌株作了初步鑒定：L-1和D-2菌株為革蘭氏陰性菌，短桿狀，無芽孢，L-1菌株在LB固體培養(yǎng)基上初期為黃色之后變?yōu)樯汉骷t色，菌落圓形，不透明，有光澤，D-2菌株在LB固體培養(yǎng)基上菌落白色、圓形、透明。

將菌株L-1和D-2的16S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大約1 500 bp的兩個(gè)片段，其擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，將所得PCR產(chǎn)物提交公司測(cè)序，得到分別得到1 491 bp和1 482 bp的序列，將該序列和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的各近緣菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用Bioedit 7.0進(jìn)行多重比較，分析其同源性，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），經(jīng)分析，菌株L-1的序列和Sphingobacterium multivorum IAM 14316（Accession No.NR_040953）顯示了99%的同源性，菌株D-2的序列和Zoogloea oryzae A-7（Accession No. AB201043）顯示了97%的同源性，根據(jù)其系統(tǒng)進(jìn)化特征，可確定菌株L-1為多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivorum）和菌株D-2為動(dòng)膠菌（Zoogloea oryzae）：

2.2 混合菌劑對(duì)原油的降解試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同原油濃度對(duì)降解效果的影響 考慮到單個(gè)菌株對(duì)原油的降解率有限，而原油成分又較為復(fù)雜，本試驗(yàn)采用混合菌劑對(duì)原油進(jìn)行降解。將篩選出的高效石油烴降解菌L-1和D-2以1∶1的比例進(jìn)行復(fù)配制成復(fù)合菌劑，以5%的接種量將其接入不同原油濃度的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同處理時(shí)間下，其原油降解結(jié)果如圖3所示，圖3顯示，隨著原油濃度和處理時(shí)間的變化，混合菌劑對(duì)原油的降解率遵循不同的規(guī)律，當(dāng)處理時(shí)間為5 d，混合菌劑對(duì)原油的降解率隨著原油濃度的增加逐漸降低，其范圍在12.4%～32.3%。當(dāng)處理時(shí)間為10～15 d時(shí)，混合菌劑對(duì)原油的降解率在原油濃度低于4 g/L時(shí)，隨著原油濃度增加而逐步升高，當(dāng)原油濃度高于4 g/L時(shí)，降解率隨著原油濃度的增加而逐步降低，當(dāng)原油濃度為4 g/L時(shí)，混合菌劑對(duì)原油的降解率達(dá)到最大，這說明了原油濃度對(duì)原油的降解率有較大的影響，高濃度原油抑制了微生物的生長(zhǎng)，而且原油濃度過大會(huì)造成降解體系中其他營(yíng)養(yǎng)元素的相對(duì)缺乏，例如微生物生長(zhǎng)所必須的氮、磷的相對(duì)缺乏，從而降低了微生物對(duì)原油的降解率。同時(shí)混合菌劑的作用時(shí)間對(duì)原油降解率也有影響，隨著混合菌劑處理時(shí)間的延長(zhǎng)，原油的降解率相對(duì)增加。當(dāng)混合菌劑的處理時(shí)間為5 d時(shí)，原油濃度為1 g/L的處理結(jié)果最佳；當(dāng)混合菌劑的處理時(shí)間為10 d和15 d時(shí)，原油濃度為4 g/L的原油降解率最高。分析其原因可能是接種混合菌劑初期，由于其不適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境，高濃度的含油量會(huì)抑制其生長(zhǎng)繁殖，從而影響了原油的降解率.當(dāng)處理時(shí)間大于10 d，即微生物適應(yīng)了環(huán)境，進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在一定范圍內(nèi)（原油濃度小于4 g/L），其原油降解率就會(huì)隨原油濃度的增加而增加。

2.2.2 不同性質(zhì)原油對(duì)降解效果的影響 相同條件下，微生物對(duì)稀油和重油的去除效果不同，其結(jié)果遵循對(duì)稀油的降解率大于對(duì)重油的降解率的規(guī)律[11]；即使是同一種原油，微生物對(duì)其不同組分也有著不同的降解率，對(duì)各組分的降解率從高到低依次為烷烴﹥芳香烴﹥膠質(zhì)和瀝青，其中各個(gè)組分含量不同，會(huì)影響原油的生物可降解性[12]?；旌暇鷦?duì)稀油和重油總烴及烷烴、芳香烴和膠質(zhì)瀝青的去除結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示對(duì)于總烴的降解率，微生物混合菌劑對(duì)稀油的作用效果大于重油，但是對(duì)于膠質(zhì)瀝青的降解率，微生物復(fù)合菌劑對(duì)重油的作用效果大于稀油，分析其原因可能是由于油中膠質(zhì)和瀝青的含量遠(yuǎn)高于稀油。從圖4還可以看出，微生物復(fù)合菌劑對(duì)原油不同組分其降解率有所不同，這是由于微生物的代謝機(jī)制不同，故而對(duì)原油各組分的降解效果不同。因此，將微生物應(yīng)用于石油污染治理中，不僅應(yīng)該考慮多菌株的混合使用，還應(yīng)該考慮菌株對(duì)芳香烴及膠質(zhì)和瀝青綜合降解效果。

2.3 復(fù)合菌劑對(duì)石油污水處理效果的影響

復(fù)合菌劑對(duì)石油污水的處理采用L16（43）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)[13]，試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，表4中R3﹥R1﹥R2，所以影響石油污水處理結(jié)果的試驗(yàn)因素的主次順序?yàn)樘幚頃r(shí)間，初始pH，接種量。

從表4可以看出，初始pH 7.5、接種量12%、處理時(shí)間96 h為理論上最理想的處理方式，但是從節(jié)約資源、減少成本和縮短試驗(yàn)周期方面考慮，最佳的試驗(yàn)方案為pH 7.5、接種量9%、處理時(shí)間為72 h。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從原油樣品中分離篩選出2株高效石油降解菌，通過分析菌株的個(gè)體和群體形態(tài)、生理生化反應(yīng)以及分子鑒定，最終確定這2株菌分別為多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivorum）和菌膠團(tuán)菌（Zoogloea oryzae）?？疾霯-1和D-2菌株石油降解能力，降解率分別達(dá)到46.5%和42.5%。所選菌株比其他研究篩選得到菌株[14，15]降解效率高、周期短。

所得兩株菌株以1∶1的比例進(jìn)行復(fù)配制成復(fù)合菌劑，測(cè)定復(fù)合菌劑對(duì)不同處理時(shí)間、不同原油濃度和不同原油組分的原油降解率，結(jié)果顯示，處理時(shí)間、原油濃度和原油組分含量均會(huì)影響復(fù)合菌劑對(duì)原油的降解率，其中，當(dāng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中原油濃度達(dá)到4 g/L時(shí)，原油的降解率最高；混合菌劑對(duì)稀油的降解效果要明顯優(yōu)于重油。

復(fù)合菌劑應(yīng)用于石油污水的處理，對(duì)其影響條件進(jìn)行3因素4水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果顯示，當(dāng)復(fù)合菌劑的接種量為9%時(shí)，石油污水的初始pH 7.5，處理時(shí)間為72 h，石油污水的處理效果最佳。

長(zhǎng)期以來人們關(guān)注石油污染并進(jìn)行了相關(guān)研究，已經(jīng)取得了一定的成果[16]，但是石油降解菌的分離篩選都是從石油污染的土壤或者石油污水中。本試驗(yàn)從原油中分離得到高效原油降解菌，將高效原油降解菌等比例復(fù)配組成復(fù)合菌劑應(yīng)用于石油污水處理的初步試驗(yàn)，取得了較好的結(jié)果，證明應(yīng)用石油降解菌處理石油污水具有很大的應(yīng)用潛力。本研究發(fā)現(xiàn)微生物對(duì)石油組分中芳香烴及膠質(zhì)和瀝青的降解率較低，下一步應(yīng)該著眼于芳香烴及膠質(zhì)和瀝青的降解菌的篩選或培育。本研究所篩選的高效石油降解菌來源于油田的原油樣品，可以進(jìn)一步嘗試應(yīng)用于高濃度石油污染土壤的修復(fù)，為石油污染的土壤修復(fù)提供參考。

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