彭 琪，朱維鈞，楊春柳，于永生，朱建君，楊性坤

(1.信陽師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 信陽 464000；2. 平頂山學(xué)院 數(shù)學(xué)與信息科學(xué)學(xué)院，河南 平頂山 467000)

0 引言

蒙脫石(montmorillonite, MMT)是一種生物惰性黏土類礦物質(zhì)，分子式為(Al,Mg)[Si4O10](OH)2·nH2O，是由硅氧四面體和鋁氧八面體所組成的2∶1型層狀硅酸鹽礦物，是膨潤土的主要礦物成分.[1]它的化學(xué)成分相當(dāng)穩(wěn)定，具有無毒、耐化學(xué)溶劑、粒徑小、晶層可被嵌入、比表面積大、易于吸附分子及較強(qiáng)的離子交換能力等特點(diǎn)[2]，它能將陽離子藥物插入MMT片層間的空隙內(nèi)，使藥物能夠緩慢地釋放出來.[3]根據(jù)含有的可交換陽離子的種類，MMT可被分為鈣基蒙脫石和鈉基蒙脫石.[4]我國出產(chǎn)的天然黏土約90%屬于鈣基蒙脫石，然而鈉基蒙脫石具有更好的吸附性及離子交換性.因此，在實(shí)驗(yàn)中開發(fā)利用MMT作為藥物釋放載體通常先將鈣基蒙脫石提純轉(zhuǎn)化為鈉基蒙脫石.[5]胰島素(Insulin, INS)是一種在人和動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的能夠降低血糖的激素，在醫(yī)學(xué)上主要被用于糖尿病的治療.然而，由于胃酸的破壞、消化酶的降解及難以跨越生物膜的機(jī)械屏障作用等因素，目前，胰島素只能以注射的形式給藥，而且通常需要長期反復(fù)地頻繁給藥，這給患者帶來了極大的痛苦.[6]為了解決以上問題，國內(nèi)外的學(xué)者進(jìn)行了大量有關(guān)口服胰島素制劑的研究，包括選擇可生物降解高分子材料、藥物結(jié)合鏈斷裂等手段，從而有望實(shí)現(xiàn)胰島素的口服給藥.[7-11]

本實(shí)驗(yàn)以河南信陽的鈣基蒙脫石為原料，先將其轉(zhuǎn)化為鈉基蒙脫石，再以胰島素為模型藥物，在一定條件下制備出INS/MMT復(fù)合物，考察鈉基蒙脫石對胰島素的吸附能力，研究pH值和釋放時(shí)間等因素對復(fù)合物體外釋放胰島素的影響規(guī)律，采用一級動(dòng)力學(xué)模型、Higuchi模型和Korsmeyer- Peppas模型分析INS在不同pH值下的釋放機(jī)理，探討蒙脫石作為胰島素的藥物緩釋載體的可行性，為進(jìn)一步開發(fā)口服胰島素制劑提供理論參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品制備

膨潤土樣品采自河南信陽.先采用濕法對膨潤土原礦進(jìn)行提純，再用1 mol/L NaCl溶液對鈣基膨潤土進(jìn)行鈉化改性.提純改性后，鈉基蒙脫石中雜質(zhì)的含量大大降低，測定其陽離子交換容量為72.3 mmol/100 g，吸藍(lán)量為40.05 mL，計(jì)算后得知，提純后鈉基蒙脫石的含量約為91%，該純度可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的相關(guān)要求.[12]

其他主要原料：胰島素精粉(提取于豬胰腺，徐州萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，27.5 IU/mg)，濃鹽酸，甘氨酸，考馬斯亮藍(lán)G-250，95%乙醇，85%磷酸，牛血清白蛋白，氨水，氯化銨.實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

準(zhǔn)確稱取600 mg胰島素粉末，加入到300 mL pH 3.5的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液中，充分溶解后加入150 mg鈉基蒙脫石，攪拌9 h后離心，從中取適量濾液，稀釋后在595 nm處測定吸光度.將沉淀用蒸餾水洗滌2～3次，干燥研磨后得到INS/MMT復(fù)合物，儲(chǔ)存于干燥器中備用.[13]

1.2 性能測試

使用日本HITACHI-U3900H型UV-Vis分光光度計(jì)測定分析溶液中INS的濃度.

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[14-15]

準(zhǔn)確稱取10 mg牛血清白蛋白，將其溶于10 mL蒸餾水，即得1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液.另準(zhǔn)確稱取10 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于5 mL95%乙醇中，加入10 mL85%(W/V)磷酸，用蒸餾水定容至100 mL，即得0.1 g/L的考馬斯亮藍(lán)溶液.精確吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，分別用蒸餾水稀釋至1 mL，再依次加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻.以不含牛血清白蛋白的試樣為空白對照，在595 nm處于5 min內(nèi)完成吸光度測定，并繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線.結(jié)果表明，在0～100 mg/L范圍內(nèi)，吸光度與濃度之間具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R為0.999 5.

1.3.2 MMT對INS的包封率和載藥量[16]

采用下面式子計(jì)算MMT對INS的包封率和載藥量.

包封率EN=m1/m2×100%,

(1)

其中：EN為蒙脫石的包封率，%；m1為復(fù)合物中包載的INS的質(zhì)量，mg；m2為復(fù)合物形成后上層清液中INS的總質(zhì)量，mg.

載藥量DL=m1/m3×100%,

(2)

其中：DL為蒙脫石的載藥量，%；m1為復(fù)合物中包載的INS的質(zhì)量，mg；m3為復(fù)合物形成后上層清液中蒙脫石的質(zhì)量，g.

1.3.3 INS/MMT 復(fù)合物的體外釋放

準(zhǔn)確稱取3份30 mg INS /MMT復(fù)合物，分別置于pH為7.4、5.0和1.2的釋放介質(zhì)中，密封后置于錐形瓶中，在37 ℃下于恒溫振蕩器中對復(fù)合物進(jìn)行體外釋放試驗(yàn).在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間取樣，同時(shí)向體系中補(bǔ)充等量的新鮮釋放介質(zhì).用紫外可見分光光度計(jì)測定樣品在595 nm處的吸光度，通過計(jì)算得出釋放介質(zhì)中INS的濃度和累積釋放量.

2 結(jié)果與討論

2.1 MMT對INS的包封率和載藥量

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算蒙脫石對INS的包封率和載藥量，得到如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：鈉基蒙脫石對INS的包封率為22.76%，載藥量為910.34 mg/g.這說明蒙脫石對INS具有較強(qiáng)的吸附能力.[12]

2.2 INS/MMT復(fù)合物的體外釋放

將復(fù)合物在3種不同pH下進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)，測定了在不同取樣時(shí)間下從INS/MMT 復(fù)合物中釋放出的INS濃度，結(jié)果見圖1.

圖1 INS/MMT 復(fù)合物在不同 pH 下的釋放曲線Fig. 1 The release curve of INS from the INS/MMT complexes in various pH aqueous solutions

對于在3種pH值下的緩釋實(shí)驗(yàn)，我們采用3個(gè)理論模型：一級動(dòng)力學(xué)模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型來研究INS從復(fù)合物中釋放的機(jī)理.[17-20]擬合結(jié)果見圖2、圖3、圖4和表1.其中，一級動(dòng)力學(xué)模型常用于多孔骨架系統(tǒng)中水溶性藥物的釋放動(dòng)力學(xué)研究，可用公式(3)表示：[17]

Qt=Q∞(1-Me-kt/Q∞).

(3)

基于菲克定律，Higuchi模型把藥物的釋放描述成擴(kuò)散過程，是擴(kuò)散型藥物釋放系統(tǒng)的典型模型，可用公式(4)表示：[20]

Qt=kHt1/2.

(4)

Korsmeyer-Peppas模型考慮到藥物分子的釋放機(jī)理通常并不完全符合菲克定律，而會(huì)表現(xiàn)出一定的無規(guī)則性，則可用公式(5)表示：[21]

Qt=kHtn,

(5)

其中：Qt是在t時(shí)刻藥物累積釋放的百分含量；Q∞是在平衡狀態(tài)下藥物釋放的百分含量；M是藥物的釋放量；t是釋放時(shí)間；k是一級釋放動(dòng)力學(xué)常數(shù)；kH是Higuchi擴(kuò)散常數(shù)，k1是Korsmeyer-Peppas模型的動(dòng)力學(xué)常數(shù)；n是釋放指數(shù).其中，當(dāng)0.45

圖2 一級動(dòng)力學(xué)模型擬合INS在不同 pH 下的釋放Fig. 2 Curve fitting of INS release rate with first order kinetics model in various pH aqueous solutions

圖3 Higuchi模型擬合INS在不同pH下的釋放Fig. 3 Curve fitting of INS release rate with Higuchi model in various pH aqueous solutions

由圖1、圖2、圖3和圖4可知：INS/MMT復(fù)合物中INS的釋放行為受溶液pH值影響較大，當(dāng)pH為7.4和1.2時(shí)，INS的釋放濃度和累積釋放量的最大值分別為181.71 mg/L、14.54%和177.85 mg/L、14.23%，均遠(yuǎn)大于pH 5.0時(shí)的釋放情況.雖然當(dāng)pH 1.2時(shí)，復(fù)合物中INS的釋放累積量在12 h內(nèi)明顯高于pH 7.4時(shí)的結(jié)果，但由于INS在強(qiáng)酸性介質(zhì)中存在12 h后會(huì)發(fā)生部分降解，因此測得的釋放濃度在釋放24 h時(shí)反而有所下降(使用紫外可見分光光度計(jì)在不同時(shí)間點(diǎn)對INS在3種pH下進(jìn)行峰形掃描，數(shù)據(jù)未給出).由此可見，中性和強(qiáng)酸性條件會(huì)更有利于INS從復(fù)合物中釋放出來.

圖4 Korsmeyer-Peppas模型擬合INS在不同 pH 下的釋放Fig. 4 Curve fitting of INS release rate with Korsmeyer-Peppas model in various pH aqueous solutions

由于胰島素的等電點(diǎn)約為5.1，在pH 5.0時(shí)稍帶正電荷，在pH 1.2時(shí)帶正電荷，在pH 7.4時(shí)帶負(fù)電荷，所帶的電荷越多，蒙脫石片層間胰島素分子間的靜電排斥作用越強(qiáng)，從而使得INS更容易釋放出來.這使胰島素在pH 1.2時(shí)比在pH 7.4時(shí)更容易釋放出來.另外，在pH 7.4時(shí)，插入到蒙脫石層間的INS與溶液中的磷酸根等陰離子間進(jìn)行的離子交換作用對藥物釋放也有一定的貢獻(xiàn).[14]當(dāng)pH 值在胰島素等電點(diǎn)附近時(shí)，INS所帶的電荷最少，復(fù)合物中INS的釋放濃度和累積釋放量最低.

當(dāng)pH 7.4時(shí)，在釋放的前12 h，復(fù)合物中INS的釋放濃度和累積釋放量均隨時(shí)間的延長而增大.在12 h后，其釋放速率逐漸變緩，釋放濃度和累積釋放量趨于穩(wěn)定.當(dāng)pH 1.2時(shí)，在7 h后，INS的釋放速率就逐漸穩(wěn)定下來.但是當(dāng)pH 5.0時(shí)，在整個(gè)釋放周期內(nèi)，INS的釋放曲線都很平緩，釋放濃度和累積釋放量均很小.由此，我們可以認(rèn)為：INS/MMT復(fù)合物中INS的釋放過程可分為2個(gè)階段：第一階段為初期，INS的釋放速率相對較快，釋放的可能是吸附在鈉基蒙脫石表面的INS，此外由于存在復(fù)合物和釋放介質(zhì)間的濃度梯度，蒙脫石表面的INS會(huì)不斷從復(fù)合物中擴(kuò)散到溶液中.第二階段是較緩慢的持續(xù)釋放過程，此時(shí)釋放的可能是插入到蒙脫石層間的INS.

將INS/MMT復(fù)合物在3種pH下的釋放數(shù)據(jù)按照一級動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi和Korsmeyer-Peppas模型進(jìn)行擬合，由擬合優(yōu)度(R2)來判斷曲線擬合情況，擬合結(jié)果見表1.由擬合結(jié)果可見，在3種不同pH下，一級動(dòng)力學(xué)方程擬合的結(jié)果最好，為藥物釋放的最佳模型.由此可推測，當(dāng)INS從復(fù)合物中釋放出來時(shí)，在濃度差的作用下，蒙脫石表面吸附的INS分子迅速擴(kuò)散，蒙脫石層間的INS也將通過擴(kuò)散作用進(jìn)入溶液.此外，在3種pH下，采用Korsmeyer-Peppas模型擬合的釋放指數(shù)都小于0.45，這說明INS從復(fù)合物中的釋放是基于Fickian擴(kuò)散機(jī)理.

綜上所述，INS/MMT復(fù)合物在中性和強(qiáng)酸性條件下可有效釋放出INS，并使藥物濃度保持恒定，因此，蒙脫石是一種性能優(yōu)良的胰島素緩釋載體.這為在將來的研究中尋求一種吸附能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好且價(jià)格低廉的口服胰島素制劑提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為河南省信陽地區(qū)礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用提供了參考依據(jù).

表1胰島素在3種pH值釋放介質(zhì)中釋放的不同動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果
Tab. 1FittingresultsofinsulinreleaseratewiththreedifferentkineticmodelsinthreepHaqueoussolutions

3 結(jié)論

本研究表明：鈉基蒙脫石對胰島素具有較高的吸附能力和緩釋作用；復(fù)合物中胰島素的釋放行為受釋放介質(zhì)pH值的影響較顯著；采用不同模型對釋藥過程進(jìn)行擬合，結(jié)果表明一級動(dòng)力學(xué)模型的擬合效果最好，這說明胰島素從復(fù)合物中釋放的行為主要由擴(kuò)散作用決定.接下來，本研究將著重對如何提高藥物的載藥量和包封率進(jìn)行深入研究.