柯丹霞 ，李祥永

(信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽464000)

0 引言

宿主豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮是自然界中最主要的一種生物固氮形式.根瘤器官的形成是豆科植物與根瘤菌之間相互識別，信號分子之間相互作用的結(jié)果.根瘤菌首先感知豆科植物根際分泌的類黃酮信號，隨后激活結(jié)瘤基因的表達(dá)，合成和分泌結(jié)瘤因子，宿主植物體內(nèi)啟動(dòng)一系列早期結(jié)瘤反應(yīng)：根毛頂端卷曲，形成牧羊拐結(jié)構(gòu)；根瘤菌在卷曲根毛頂端增殖，侵入線形成；根皮層細(xì)胞迅速分裂，形成根瘤原基；侵入線內(nèi)的根瘤菌釋放，進(jìn)入根瘤原基.根瘤菌侵染和根瘤器官發(fā)生這兩個(gè)過程協(xié)同發(fā)展最終形成有固氮功能的根瘤[1].

豆科植物與根瘤菌共生關(guān)系的建立極為復(fù)雜，但有序.通過對豆科植物不結(jié)瘤突變株的研究，結(jié)瘤早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑開始逐步明晰.早在1985年，Carrol和Gresshoff等人就通過EMS化學(xué)誘變的方法從大豆中分離到超量結(jié)瘤和不結(jié)瘤突變株[2]，接著在其他豆科植物如豌豆、三葉草，以及模式豆科植物百脈根和苜蓿中也獲得超量結(jié)瘤和不結(jié)瘤突變株.自2002年以來，隨著兩大模式豆科植物百脈根(Lotusjaponicus)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中關(guān)鍵共生調(diào)控基因的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，結(jié)瘤早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型初步建立起來,見圖1[3].目前單一的對某個(gè)蛋白在共生互作中功能的研究已經(jīng)達(dá)到飽和，以此結(jié)瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型為基礎(chǔ)，檢測信號途徑中已知蛋白間的相互作用，確定蛋白質(zhì)相互作用的活性位點(diǎn)，尋找與已知蛋白相互作用的新蛋白，從生化和分子水平上進(jìn)一步研究蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已成為當(dāng)今共生固氮領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn).近年來，許多與已知關(guān)鍵調(diào)控蛋白互作的新蛋白已經(jīng)從模式豆科植物中被篩選出來，并且這些蛋白也被證實(shí)在根瘤共生過程中發(fā)揮重要作用，結(jié)瘤早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑因此得到進(jìn)一步的補(bǔ)充和完善.本文以根瘤共生為視角，主要介紹參與早期共生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控蛋白特別是與已知蛋白互作的新蛋白的最新研究進(jìn)展，以期為豆科植物與根瘤菌共生關(guān)系的研究提供參考.

圖1 結(jié)瘤信號傳導(dǎo)模式圖Fig. 1 Nodulation signaling transduction pattern.

1 結(jié)瘤因子受體激酶及其互作蛋白

不同種類豆科植物的結(jié)瘤因子受體蛋白激酶陸續(xù)被篩選出來：包括百脈根中的LjNFR1和LjNFR5[4-5]；苜蓿中的MtLYK3/MtLYK4和MtNFP[6-8]；豌豆中的PsSYM37和PsSYM10[9]以及大豆中的GmNFR1α/β和GmNFR5α/β[10].不同豆科植物中鑒定到的結(jié)瘤因子受體被統(tǒng)一歸為LysM類受體激酶(LysM-RLKs)，由膜內(nèi)的絲/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、中部跨膜結(jié)構(gòu)域和膜外2～3個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域共同組成.

在大多數(shù)真核生物的蛋白激酶中，調(diào)節(jié)激酶活性的激活環(huán)位于蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域，而磷酸化位點(diǎn)一般位于激活環(huán)(activation loop).模式豆科植物百脈根的結(jié)瘤因子受體蛋白激酶LjNFR1和苜蓿的結(jié)瘤因子受體蛋白激酶MtLYK3均含有激活環(huán)，因此具有蛋白激酶活性.另外的兩個(gè)結(jié)瘤因子受體蛋白激酶LjNFR5和MtNFP因?yàn)槿鄙偌せ瞽h(huán)而不具備磷酸化活性.體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)LjNFR1是典型的蛋白激酶，具有自磷酸化和底物水平磷酸化活性.LjNFR1通過磷酸化LjNFR5，將結(jié)瘤因子信號傳遞到下游.與此同時(shí)，LjNFR1和LjNFR5可以在煙草和韭蔥細(xì)胞內(nèi)形成異源二聚體[11]，并且LjNFR1和LjNFR5能夠高親和性地直接結(jié)合結(jié)瘤因子(NF)[12].最新研究發(fā)現(xiàn)LjNFR5的LysM2結(jié)構(gòu)域結(jié)合NF，由此引起LysM2結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生變化[13].這些生化上的直接證據(jù)進(jìn)一步證實(shí)結(jié)瘤因子受體蛋白激酶可能以異源二聚體的形式與NF相結(jié)合，共同參與接收NF信號，然后通過兩個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域之間的轉(zhuǎn)磷酸作用傳遞NF信號,見圖2[1].

圖2 NFR1和NFR5共同識別結(jié)瘤因子Fig. 2 Perception of nod factors by NFR1 and NFR5.

NFR5如何將NF信號傳遞到下游，這一過程是否需要新的蛋白參與.筆者前期利用酵母雙雜交技術(shù)在百脈根中篩選到與NFR5相互作用的小G蛋白ROP6.證實(shí)NFR5與ROP6在植物細(xì)胞的細(xì)胞膜相互作用，ROP6基因的表達(dá)依賴于根瘤菌的侵染，其RNA干擾實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致侵染線形成和根瘤數(shù)目下降，表明ROP6作為正調(diào)節(jié)子參與根瘤菌對豆科植物的侵染和根瘤的發(fā)育[14].ROP作為分子開關(guān)，有著極其復(fù)雜和保守的調(diào)控機(jī)制，ROP與RopGAP、RopGEF和RopGDI作為一個(gè)調(diào)控體系共同發(fā)揮功能.因此，為了闡明ROP6對其互作蛋白NFR5的調(diào)控機(jī)制，下一步必須尋找ROP6相對應(yīng)的調(diào)節(jié)子RopGAP、RopGEF和RopGDI，即將ROP類小G蛋白介導(dǎo)的信號通路引入共生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中.

在苜蓿中利用酵母雙雜交技術(shù)也篩選到MtLYK3(LjNFR1的同系物)的相互作用蛋白PUB1.生物信息學(xué)分析表明PUB1含有植物保守的U-box結(jié)構(gòu)域，體外蛋白實(shí)驗(yàn)證實(shí)PUB1具有E3泛素連接酶活性.MtLYK3的激酶結(jié)構(gòu)域能夠磷酸化PUB1，二者共定位于植物的細(xì)胞膜.PUB1的超表達(dá)和RNAi實(shí)驗(yàn)顯示PUB1負(fù)調(diào)控根瘤菌的侵染過程，是共生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一個(gè)新的負(fù)調(diào)節(jié)子[15].此外，苜蓿中的MtSYMREM1能夠分別與MtLYK3與MtNFP互作，MtSYMREM1屬于Remorin蛋白，是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的與質(zhì)膜/脂筏相連的植物專一性蛋白家族.對MtSYMREM1的表達(dá)譜和功能缺失突變體研究發(fā)現(xiàn)MtSYMREM1參與調(diào)控侵染線的形成.MtSYMREM1在質(zhì)膜通過調(diào)控受體蛋白參與侵染早期過程，影響侵染線的極性生長以及根瘤菌的釋放[16].隨后，在百脈根中也克隆到MtSYMREM1的同系物L(fēng)jSYMREM1.LjSYMREM1能夠與受體蛋白在體內(nèi)瞬時(shí)互作，在體外LjSYMREM1的N-端結(jié)構(gòu)域能夠被受體蛋白磷酸化.進(jìn)一步的生物學(xué)功能研究證實(shí)其在根瘤菌侵染中發(fā)揮作用[17].

綜上，一些與結(jié)瘤因子受體蛋白互作的新蛋白被發(fā)現(xiàn)，并且越來越多的蛋白也被證實(shí)調(diào)控根瘤菌早期侵染過程，但是這些蛋白與結(jié)瘤因子受體蛋白是如何協(xié)作共同調(diào)控早期侵染過程的，以及這些蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系是怎樣的目前仍不清楚，還需要將來更深入和細(xì)致的研究來揭示和闡明.

2 共生受體激酶及其互作蛋白

最初在百脈根中克隆到的共生受體激酶基因是SymRK(symbiosis receptor kinase)[18]，其編碼富含亮氨酸重復(fù)序列的類受體激酶(LRR-RLK).SymRK定位于質(zhì)膜和侵入線膜上.在蒺藜苜蓿中的同源基因?yàn)镈MI2 (do not make infections)，紫花苜蓿中為NORK(nodulation receptor kinase)[19].

通過酵母雙雜交的方法，以MtDMI2的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌，在苜蓿中篩選到甲羥戊酸合酶HMGR1.甲羥戊酸是植物類固醇類激素、細(xì)胞分裂素等特定類異戊二烯類物質(zhì)的重要前體，而研究人員篩選到的HMGR1蛋白能夠催化甲羥戊酸這一重要物質(zhì)的合成.基因沉默實(shí)驗(yàn)表明HMGR1參與根瘤菌的侵染及根瘤器官發(fā)生兩個(gè)過程[20].在百脈根中通過酵母雙雜交的方法，以LjSymRK的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌，相繼篩選到ARID型DNA綁定蛋白LjSIP1，E3連接酶LjSINA4和LjSIE3，以及MAP激酶激酶LjSIP2.LjSIP1為一個(gè)具有DNA結(jié)合功能的轉(zhuǎn)錄因子，主要和富含AT的序列結(jié)合(ARID)，并且能特異結(jié)合起始結(jié)瘤基因NIN的啟動(dòng)子序列.LjSIP1蛋白在細(xì)胞中定位于細(xì)胞核，它并不是SymRK蛋白的磷酸化底物[21].后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)了SIP1的變異體SIP1L，SIP1L 在C端含有額外的17個(gè)氨基酸.與SIP1不同的是，SIP1L不能夠與SymRK互作.SIP1L和SIP1能夠形成異源二聚體.SIP1-RNAi轉(zhuǎn)基因植株抑制結(jié)瘤，超表達(dá)SIP1L和 SIP1都能夠增加根瘤數(shù)目，說明SIP1正調(diào)控結(jié)瘤過程[22].Wang (2013)等推測在進(jìn)化過程中SIP1L在百脈根中的功能喪失，由較短的剪接變體SIP1與SymRK互作將共生信號傳遞到下游.此外，研究發(fā)現(xiàn)來自兩個(gè)不同家族的E3泛素連接酶LjSINA4和LjSIE3均能與SymRK蛋白互作.LjSINA4負(fù)調(diào)控根瘤菌的侵染過程，而與之相反的是LjSIE3正調(diào)控根瘤菌的侵染過程.異位表達(dá)LjSINA4導(dǎo)致侵染線不能正常發(fā)育，SymRK的蛋白表達(dá)也受到抑制[23].LjSIE3在植物體內(nèi)具有介導(dǎo)SymRK泛素化修飾的功能，而不能介導(dǎo)SymRK蛋白泛素化降解.基因超表達(dá)和RNA干擾研究表明，LjSIE3正調(diào)控根瘤菌侵染過程[24].兩種不同的E3泛素連接酶雖然都能與SymRK蛋白互作，但是由于作用機(jī)制不同，導(dǎo)致兩種蛋白在調(diào)控根瘤菌侵染過程中功能相反.MAP激酶激酶參與植物體內(nèi)多種生理活動(dòng)，在百脈根早期結(jié)瘤信號途徑中，也篩選到一個(gè)MAP激酶激酶LjSIP2能夠與SymRK相互作用.體外磷酸化實(shí)驗(yàn)表明SIP2和SymRK不能互為磷酸化底物，但是SymRK能夠負(fù)調(diào)控SIP2的激酶活性.RNAi分析表明，SIP2表達(dá)量的減少導(dǎo)致侵染線和根瘤原基數(shù)目明顯減少[25].Remorin家族蛋白LjSYMREM1和MtSYMREM1也能夠分別與共生受體激酶SymRK和DMI2互作，推測其在共生過程中可能作為支架蛋白從空間上參與調(diào)控信號傳導(dǎo)復(fù)合物的裝配[16-17].

上述的研究結(jié)果說明，共生受體激酶可能與這些蛋白之間形成復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控豆科植物與根瘤菌的共生過程.Chen等(2012)首次在根瘤共生信號途徑中發(fā)現(xiàn)MAP激酶的蹤跡，該研究補(bǔ)充和完善了MAPK信號傳遞網(wǎng)絡(luò)，也為共生固氮領(lǐng)域的研究提供了新的視角.水稻OsRac1(LjROP6的同系物)通過OsMAPK3/6 級聯(lián)調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子RAI1，從而將天然免疫信號傳遞到下游[26].由此推測，筆者前期鑒定的LjROP6是否也與MAPK級聯(lián)成員LjSIP2存在一定的聯(lián)系，從而通過NFR5→ROP6→SIP2信息流將共生信號傳遞到下游，這個(gè)推測還需要大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來證實(shí).此外，植物體內(nèi)為什么存在三個(gè)受體激酶，結(jié)瘤因子受體激酶與共生受體激酶之間的關(guān)系又是怎么樣的也是研究人員一直困惑并試圖解決的難題.

3 鈣離子與鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶及其互作蛋白

CCaMK編碼鈣離子和鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶[27].生化分析表明CCaMK受Ca2+和CaM雙調(diào)控，使得CCaMK能夠識別復(fù)雜的鈣離子信號，是解碼共生信號傳導(dǎo)中Ca2+振蕩信號的主要候選蛋白.CCaMK參與根瘤菌侵染過程，在根瘤器官發(fā)生過程中也發(fā)揮重要調(diào)控作用[28].2008年，研究人員利用酵母雙雜交技術(shù)，在百脈根中篩選出一個(gè)新的蛋白CYCLOPS與CCaMK相互作用，在苜蓿中也鑒定出一個(gè)新蛋白IPD3[29-30].CYCLOPS/IPD3是CCaMK的磷酸化底物，CCaMK通過磷酸化CYCLOPS/IPD從而參與調(diào)控根瘤菌侵染過程，但是并不影響根瘤的器官發(fā)生[30].2011年，研究人員在百脈根中鑒定到一個(gè)CCaMK相互作用的新蛋白CIP73.體外蛋白實(shí)驗(yàn)證實(shí)在Ca2+和CaM存在時(shí)，CIP73的N端1～413位氨基酸區(qū)域能夠被CCaMK磷酸化.RNAi分析表明CIP73參與根瘤的器官發(fā)生過程，而不影響根瘤菌的侵染[31].上述研究表明，CCaMK能夠通過與不同的蛋白相互作用分別激活根瘤菌侵染和根瘤器官發(fā)生兩個(gè)過程.

4 NSP轉(zhuǎn)錄因子及其互作蛋白

在百脈根和苜蓿中，NSP1和NSP2都屬于GRAS(GAI、RGA、SCR)家族蛋白[32-33].這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控結(jié)瘤因子誘導(dǎo)的早期結(jié)瘤基因表達(dá)、根瘤形成等過程.生化研究表明，LjNSP2 能夠與自身結(jié)合形成同源二聚體[34].苜蓿中NSP1和NSP2在細(xì)胞核內(nèi)形成異源蛋白復(fù)合體，并且能夠結(jié)合ENOD11、 NIN 和ERN等早期結(jié)瘤素基因的啟動(dòng)子[35].NSP1與NSP2結(jié)合可以作為強(qiáng)調(diào)節(jié)子正調(diào)控ERN1和ENOD11的翻譯.在根瘤菌侵染前期，ERN1專一性地激活由NF誘導(dǎo)的ENOD11的表達(dá)，在隨后的根瘤菌侵染過程中，NSP1/NSP2介導(dǎo)ENOD11表達(dá)[36].

研究人員試圖通過篩選酵母雙雜交文庫鑒定與NSP轉(zhuǎn)錄因子相互作用的新蛋白.最新的研究顯示，一個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子能夠特異的與NSP2相互作用，命名為IPN2.IPN2具有轉(zhuǎn)錄自激活活性,并且能夠結(jié)合NIN基因的啟動(dòng)子.在酵母中進(jìn)一步確定兩種蛋白相互作用的活性位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)NSP2的GRAS結(jié)構(gòu)域和IPN2的卷曲-卷曲結(jié)構(gòu)域是二者相互作用所必需的關(guān)鍵作用區(qū)段.利用百脈根毛根轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)現(xiàn)NSP2和IPN2共定位于毛根細(xì)胞的細(xì)胞核中.RNA干擾實(shí)驗(yàn)表明IPN2在根瘤器官發(fā)生過程中行使重要功能[37].IPN2的發(fā)現(xiàn)將MYB類轉(zhuǎn)錄因子引入共生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了豆科植物與根瘤菌的早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.

5 結(jié)瘤起始蛋白NIN及其相關(guān)蛋白

結(jié)瘤起始蛋白NIN是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，含有一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域.研究表明，NIN不影響結(jié)瘤因子的感知，根毛的變形等早期反應(yīng)，但NIN參與侵染線的形成，控制結(jié)瘤數(shù)量，推測其可能通過調(diào)控早期結(jié)瘤素基因ENOD11的空間表達(dá)從而發(fā)揮功能[38].兩個(gè)核因子LjNF-YA1和LjNF-YB1作為NIN的轉(zhuǎn)錄靶物，二者在根瘤原基中表達(dá)，在植物細(xì)胞中形成NF-Y蛋白復(fù)合物.LjNF-YA1敲除實(shí)驗(yàn)抑制根瘤器官發(fā)生.超表達(dá)NIN，在不接種根瘤菌的情況下，皮層細(xì)胞也能夠分裂形成類似根瘤原基的結(jié)構(gòu).豆科植物根瘤的發(fā)育與NIN 功能的變化緊密相連，NIN的一個(gè)重要功能就是調(diào)控根瘤器官發(fā)生過程中的細(xì)胞分裂[39].NIN是結(jié)瘤起始關(guān)鍵蛋白，在豆科植物中特異存在，而NF-Y在真核生物中普遍存在.

最新的研究又發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)在根瘤器官發(fā)生過程中行使功能的調(diào)控蛋白LjIPT3正調(diào)控結(jié)瘤過程，RNAi植株侵染線和結(jié)瘤數(shù)目減少.LjIPT3介導(dǎo)的CRE1依賴的細(xì)胞分裂素途徑參與調(diào)控結(jié)瘤過程，LjIPT3調(diào)控結(jié)瘤起始和發(fā)育，不參與早期侵染事件[40].LjVAG1介導(dǎo)的皮層細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制是引導(dǎo)共生根瘤菌進(jìn)入宿主植物分生組織細(xì)胞所必需的，因此LjVAG1也在根瘤器官發(fā)生過程中發(fā)揮作用[41].

6 結(jié)語

近10年來，豆科植物與根瘤菌共生固氮的分子機(jī)理研究取得了重大進(jìn)展.利用模式豆科植物遺傳資源，研究人員鑒定出大量與結(jié)瘤相關(guān)的關(guān)鍵基因.但是基因產(chǎn)物的確切生物學(xué)功能以及調(diào)控機(jī)制還不甚明晰；通過正向遺傳學(xué)方法從傳統(tǒng)誘導(dǎo)得到的共生突變體中分離基因似乎也已經(jīng)達(dá)到飽和；當(dāng)前的研究依然停留在鑒定涉及共生信號途徑某一階段的功能上.因此，如何將這些已知調(diào)控蛋白從生化上彼此聯(lián)系起來，明確蛋白與蛋白之間的時(shí)空調(diào)控，上位/下位關(guān)系，篩選新的相互作用蛋白，進(jìn)而將這些蛋白與不同的共生過程包括共生信號識別、根瘤菌侵染、根瘤器官發(fā)生、根瘤形成以及有功能(固氮)共生體建立等相對應(yīng)，從而建立一個(gè)完整的植物與微生物共生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將是下一步亟待解決的問題.

豆科植物在環(huán)境及農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用長期以來一直受到人們的廣泛關(guān)注.在過去十年里，積累了大量的共生突變體和基因，隨著轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等分析方法的完善和大量創(chuàng)新工具的快速建立，不僅在模式豆科植物上，甚至在重要的豆科農(nóng)作物大豆上將會有更多全新的有意義的研究成果誕生.更深遠(yuǎn)的是人們期望能夠通過遺傳工程的方法將豆科植物與根瘤菌之間的這一復(fù)雜但精細(xì)的共生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)移到非豆科糧食作物上，實(shí)現(xiàn)重要谷類作物的共生固氮.隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和新資源平臺的出現(xiàn), 我們有理由相信實(shí)現(xiàn)非豆科植物的根瘤共生已經(jīng)成為可能.