摘要；利用高分離度快速液相色譜與四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（RRLCQTOF MS）聯(lián)用技術(shù)，對酒制人參和醋制人參的人參皂苷類成分進(jìn)行比較研究。樣品經(jīng)不同方法炮制，離心過濾后，采用Agilent ZORBAX SBC18 色譜柱，以0.1% 甲酸和乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行檢測，利用Masshunter Qualitative Analysis軟件與人工相結(jié)合進(jìn)行分析。鑒定了46種人參皂苷，比較了酒制人參和醋制人參中人參皂苷含量差異，并檢測到稀有人參皂苷。同時(shí)總結(jié)了炮制品中人參皂苷的轉(zhuǎn)化途徑。對人參置于酒或醋中有效成分的浸出量進(jìn)行比較。本方法對于人參炮制品的成分研究具有借鑒意義，并且對民間使用的人參泡酒進(jìn)行了科學(xué)解釋，為人參炮制品在臨床合理使用提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞；酒制人參；醋制人參；人參皂苷；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1引言

人參是五加科植物人參（Panax ginseng C. A. Mey.）的干燥根，具有益智、提高免疫力、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等功效，主要有效成分是人參皂苷 [1]。人參皂苷屬于三萜類化合物，共三類，分別是原人參二醇型皂苷（Protopanaxadiol，PPD）、圖1原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷的結(jié)構(gòu)式

當(dāng)R3=OH為原人參三醇型皂苷，當(dāng)R3=H為原人參二醇型皂苷。

R3=OH，panaxatriol ginsenosides； R3=H， panaxadiol ginsenosides.原人參三醇型皂苷（Protopanaxatriol，PPT）（骨架結(jié)構(gòu)示于圖1）和齊墩果烷型人參皂苷（Oleanolic acid）。按照其C20位結(jié)構(gòu)的不同，又可以分為20（S）型和20（R）型，天然人參皂苷構(gòu)型均為20（S）型。

人參有紅參、生曬參、大力參等炮制品 [2～4 ]。研究表明，人參經(jīng)過加工炮制后，所含有效成分發(fā)生復(fù)雜變化，同時(shí)伴有新物質(zhì)生成[5]，民間將新鮮人參置于酒中浸泡后服用，達(dá)到保健的目的 [6]，但很少進(jìn)行科學(xué)解釋。中醫(yī)理論中，藥材經(jīng)醋炮制后，可以增強(qiáng)治療作用的例子有很多[7]。據(jù)報(bào)道，人參皂苷在酸性環(huán)境下能夠轉(zhuǎn)化成具有很強(qiáng)生物活性的稀有皂苷[8]。

高分離度快速液相色譜與四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（RRLCQTOF MS）聯(lián)用技術(shù)常用于天然產(chǎn)物的化學(xué)成分分析[9]，Wang等[10]利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測人參和西洋參中人參皂苷類化合物的差異，本實(shí)驗(yàn)利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，比較人參通過醋及酒炮制后的化學(xué)成分變化，為其質(zhì)量評價(jià)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、試劑與材料

Agilent 1200型快速分離液相色譜系統(tǒng)，Agilent 6520 QTOF 質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）。鮮人參、生曬參（5年）均購于吉林省撫松縣萬良人參市場，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為五加科植物人參Panax ginseng C.A. Mey.的根）；人參皂苷Rg2， Rg3， Rb1， Rc， Rd， Re和Rf等對照品（純度>98%， 南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；乙腈（色譜純）；其它試劑均為分析純。醋（山西水塔醋業(yè)股份有限公司，總酸≥4.00 g/100 mL）；白酒（北京雙慶和酒業(yè)有限責(zé)任公司，酒精度：56% Vol）；黃酒（浙江圣塔紹興酒有限公司，酒精度：8% Vol）。

2.2樣品的制備

鮮人參分別用3種浸泡液（醋、白酒、黃酒）浸泡48 h后，高壓蒸鍋100℃蒸制2.5 h，冷卻至室溫，于烘箱60℃干燥72 h。等量的浸泡液，備用。

分別稱取1 g生曬參粉末，加入20 mL 70%甲醇，浸泡過夜，超聲60 min，以5000 r/min 離心10 min，過0.22 μm濾膜，備用。浸泡液制備方法同上。

2.3實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件：

色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18 色譜柱 （100 mm×2.1 mm，3.5 μm），梯度洗脫； 流動相：0.1% 甲酸溶液（A），乙腈（B）； 流動相梯度：0～2 min，0%～10% B； 2～7 min，10%～15% B； 7～15 min，15%～30% B； 15～21 min，30%～39% B； 21～33 min，39%～50% B； 33～44 min，50%～68%B； 44～50 min， 68%～100% B。柱溫35℃； 流速 0.3 mL/min； 進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件： 采用電噴霧負(fù)離子掃描模式（ESI

Symbolm@@ ），干燥氣（N2）流速9 L/min，干燥氣溫度300℃，霧化氣壓力2.41×105 Pa，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，碎裂電壓175 V，錐孔電壓65 V，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～2000。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Masshunter Qualitative Analysis（B. 03. 01）軟件分析處理。

3結(jié)果與討論

3.1線性范圍和檢出限

選擇人參中主要成分人參皂苷Rg2和Rf為對照品，按照2.3節(jié)中色譜、質(zhì)譜條件， 通過RRLCCeTOF聯(lián)用技術(shù)分析計(jì)算線性范圍和檢出限。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在0.025～2.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)，Rg2對照品的相關(guān)系數(shù)為0.994，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。在0.1～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，Rf對照品的相關(guān)系數(shù)為0.995，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算得Rg2和Rf對照品的檢出限分別為0.0010和0.0012 mg/kg（表1）。

[KH*4D][HT5”SS][HJ*4]表1對照品人參皂苷Rg2和Rf的線性范圍、回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限

3.2不同炮制品化學(xué)分析及比較

人參皂苷在ESI負(fù)離子模式下的一級質(zhì)譜圖中，準(zhǔn)分子離子主要以[M-H]

Symbolm@@ 的形式存在[11]。通過RRLCQTOF MS獲得標(biāo)準(zhǔn)對照品提供的質(zhì)譜信息和供試品一級譜中的分子質(zhì)量信息，以及二級串聯(lián)質(zhì)譜分析得到碎片信息，確定苷元類型和所連糖基的種類和數(shù)量，進(jìn)而確定人參皂苷結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用提取離子流（EIC）方法分析。以丙二酰基人參皂苷mRb1為例，說明其它人參皂苷的鑒定方法。人參皂苷mRb1是二醇型人參皂苷，其C3 位取代是一分子丙二?；蛢煞肿拥钠咸烟切纬傻膫?cè)鏈，C20位為兩分子葡萄糖連接而成。丙二酰基人參皂苷mRb459 是二醇型人參皂苷的特征離子。這與文獻(xiàn)＼[4＼]報(bào)道的信息一致，可推測此物質(zhì)為人參皂苷mRb1。用同樣的方法可以判定所測得的人參皂苷RRLCMS/MS數(shù)據(jù)（表2）。

表2為3種人參炮制品和生曬參的化學(xué)成分鑒定和相對含量比較。由于生曬參的炮制過程中未經(jīng)過高溫蒸制，因此生曬參的皂苷類成分中存在天然的丙二?；惾藚⒃碥?。而炮制品在這個(gè)過程中經(jīng)過溶液浸泡和高溫蒸制，會有一部分丙二酰基類人參皂苷水解脫去了丙二?；?，生成了相應(yīng)的人參皂苷，如mRd經(jīng)水解生成了Rd，因此在炮制品中類似Rd這樣生成相應(yīng)的人參皂苷的含量會明顯增加。炮制品中存在著一些生曬參中沒有檢測出的成分，如人參皂苷Rh2， F2， Rg4， Rg5， Rg6， Rk3等。人參皂苷Rh2是重要的抗腫瘤活性成分，人參皂苷Rk3對順鉑所致的腎毒性具有保護(hù)作用，這些成分的變化是人參蒸制藥效改變的物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。有少數(shù)的人參皂苷含量上發(fā)生較大改變。例如， 在酸環(huán)境下人參皂苷主要的轉(zhuǎn)化標(biāo)志性產(chǎn)物為Rg3[13， 14]。這是由于人參皂苷C3位和C20的糖基不穩(wěn)定造成的。醋制人參對人參皂苷的轉(zhuǎn)化效果最明顯。

W： 生曬參； V： 醋制人參； D： 白酒制人參； M： 黃酒制人參； 編號1～21為二醇型人參皂苷，編號22～34為三醇型人參皂苷，編號35為齊墩果烷型人參皂苷，編號35～46為其它類型皂苷?！?”代表未檢測到，“+”代表峰面積為0～2×105，“++”代表峰面積為（2×105～5×105，“+++” 代表峰面積大于5×105。

W： White ginseng； V： Vinegar processed ginseng； D： Distilled spirit processed ginseng； M： Millet wine processed ginseng， No. 1-21： Panaxadiol ginsenosides； No.22-34： Panaxatriol ginsenosides； No.35： Oleanolic acid； No. 35-46： Others. “ -” ： No detected； “+” ： Peak area are less than 2×105； “++” ： Peak area are 2×105-5×105； “+++” ： Peak area are above 5×105.[BG）W][HT5][HJ]

3.3原人參二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化途徑

以醋制人參中的原人參二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化途徑為例，人參皂苷Rb1 （1108）， Rb2 （1078）， Rb3 （1078）， Rc （1078） 的C3位和C20分別連有不同的糖基，如人參皂苷Rb3在 RRLCQTOFMS一級譜中的準(zhǔn)分子離子為[M-H]Symbolm@@ （m/z 1077.5851），在ESIMS/MS 條件下發(fā)生碎裂產(chǎn)生一系列碎片離子，其中m/z 945是m/z 1077離子失去C20位木糖基C5H8O4（132 U）碎片產(chǎn)生的，m/z 783是m/z 1077 離子失去C20位木糖基碎片并且失去一個(gè)葡萄糖基C6H10O5碎片產(chǎn)生的，m/z 621是m/z 1077離子失去C20位木糖基碎片且分別失去兩個(gè)葡萄糖基C12H20O10碎片產(chǎn)生的，m/z 459是m/z 1077離子失去C20位和C3位所有取代糖基碎片產(chǎn)生的。炮制過程中，人參皂苷Rb1， Rb2， Rb3， Rc會發(fā)生C20位的取代基優(yōu)先失去，C3位保持不變。即轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rd （946）。繼續(xù)轉(zhuǎn)化會有兩條途徑：第一條途徑是人參皂苷失去C3位的葡萄糖基C6H10O5（162 u）和C20位的一個(gè)糖基，產(chǎn)生人參皂苷F2。F2失去C3位或者C20位的糖基后分別轉(zhuǎn)化成人參皂苷CK和Rh2（圖3）。第二條途徑是人參皂苷失去C20位的糖基并且C3位的取代基不變，即轉(zhuǎn)化成C20位R/S構(gòu)型的Rg3。Rg3接著失去C3位的一個(gè)葡萄糖取代基，轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rh2。最后Rg3經(jīng)過水合作用或者脫水作用分別可以生成人參皂苷CY和人參皂苷Rk1/Rg5（提取離子流圖見圖4）。RRLCQTOFMS一級譜中Rk1/Rg5的含量大于人參皂苷CY，可以說明脫水作用占主導(dǎo)。

3.4浸泡液的化學(xué)成分分析

在常溫下，采用等量醋、白酒及黃酒浸泡相同質(zhì)量的鮮人參，考察人參中有效化學(xué)成分的浸出含量，以峰面積作為比較單位（圖5）。結(jié)果表明，浸泡液RRLCQTOFMS一級譜中可以檢測到大量人參皂苷，含量依次是：醋>黃酒>白酒。浸泡液中人參皂苷含量差異的原因可能是人參皂苷更易溶于低pH值且極性大的溶液，而白酒浸泡液中的人參皂苷成分并不是最多的。民間使用人參泡酒服用的習(xí)慣，可能是由于古代保鮮防腐的手段有限，而作為一種流傳至今的保鮮方法，或者由于白酒浸泡液的口感較好。

3.5小結(jié)

本研究表明，生曬參中主要的人參皂苷在炮制品中均可找到，而且人參皂苷含量相差不大，但炮制人參含有很多稀有人參皂苷，如人參皂苷Rh2， F2， Rg4， Rg5， Rg6和Rk3等。醋制人參轉(zhuǎn)化生成人參皂苷Rg3效果十分明顯，可以作為制備稀有人參皂苷的一種手段，同時(shí)對原人參二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化途徑進(jìn)行系統(tǒng)研究。黃酒制人參浸出人參皂苷的效果優(yōu)于白酒制人參，但稍遜于醋制人參。

References

1Choi K. Acta Pharmacologica Sinica， 2008， 29（9）： 1109-1118

2ZHENG Zhong， SONG FengRui， LIU ShuYing， LIU ZhiQiang. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society， 2013， 33（6）： 327-333

鄭 重， 宋鳳瑞， 劉淑瑩， 劉志強(qiáng). 質(zhì)譜學(xué)報(bào)， 2013， 33（6）： 327-333

3LI HaiSheng， ZHOU JingYuan， LIU Hong. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 1996， 27（10）： 624-626

李海生， 周靜遠(yuǎn)， 劉 虹. 中草藥， 1996， 27（10）： 624-626

4HAO Ying， YU ShanShan， DAI YuLin， ZHANG Ying， ZHONG Wei， LIU ShuYing， YUE Hao. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society， 2014， 35（4）： 311-316

郝 穎， 于珊珊， 戴雨霖， 張 穎， 鐘 薇， 劉淑瑩， 越 皓. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)， 2014， 35（4）： 311-316

5ZHANG Miao， QIN KunMing， LI WeiDong， YIN FangZhou， CAI Hao， CAI BaoChang. China journal of Chinese Material Medica.， 2014， 39（19）： 3701-3706

張 淼， 秦昆明， 李偉東， 殷放宙， 蔡 皓， 蔡寶昌. 中國中藥雜志， 2014， 39（19）： 3701-3706

6Kim D K， Baik M Y， Kim H K， Hahm Y T， Kim B Y. Korean Journal of Food Science and Technology， 2012， 44（2）： 179-184

7WANG Jing， MAO ChunQin， LUTuLin. Chinese Journal of Information on TCM， 2009， 16（1）： 99-101

王 靜， 毛春芹， 陸兔林. 中國中醫(yī)藥信息雜志， 2009， 16（1）： 99-101

8Wu W， Qin Q J， Guo Y Y， Sun J H， Liu S Y. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60（40）： 10007-10014

9DAI YuLin， YU ShanShan， ZHANG Ying， HAO Ying， ZHONG Wei， YUE Hao， LIU ShuYing. Chem. J. Chinese Universities， 2014， 35（7）： 1396-1402

戴雨霖， 于珊珊， 張 穎， 郝 穎， 鐘 薇， 越 皓， 劉淑瑩. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 35（7）： 1396-1402

10Wang X M， Sakuma T， AsafuAdjaye E， Shiu G K. Anal. Chem.， 1999， 71（8）： 1579-1584

11LI Li， LIU ChunMing， WU Wei， YUE Hao， LIU ZhiQiang， LIU ShuYing， TIAN Cheng. Chinese J. Anal. Chem.， 2005， 33（8）： 1087-1090

李 麗， 劉春明， 吳 巍， 越 皓， 劉志強(qiáng)， 劉淑瑩， 田 成. 分析化學(xué)， 2005， 33（8）： 1087-1090

12Beak S H， Piao X L， Lee U J， Kim H Y， Park J H. Biol. Pharm. Bull， 2006， 29（10）： 2051-2055

13Kim M H， Lee Y C， Choi S Y， Cho C W， Rho J， Lee K W. Journal of Ginseng Research， 2011， 35（4）： 497-503

14Yi J H， Kim M Y， Kim Y C， Jeong W S， Bae D W， Hur J M， Jun M. Food Science and Biotechnology， 2010， 19（3）： 647-653

AbstractRapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupoletimeofflight tandem mass spectrometry （RRLCQTOF MS/MS） was used for the comparative analysis of ginsenosides composition in white ginseng， vinegar processed ginseng， distilled spirit processed ginseng and millet wine processed ginseng. Under the optimal chromatographic conditions including ZORBAX SBC18 column （100 mm×2.1 mm， 3.5 μm） at 35℃， 5 μL of injection volume and wateracetonitrile gradient elution as mobile phase with a flow rate of 0.3 mL/min， 46 kinds of ginsenosides were identified by the comparison of the retention time of the standard compound and the accurate mass obtained from RRLCQTOF MS/MS. The rare ginsenosides were detected by the comparison of white ginseng with Processedginseng， such as ginsenoside Rh2， F2， Rg4， Rg5， Rk3 etc. The method has reference significance for the research of compounds in the processed Chineseherbs.

KeywordsProcessedginseng； Ginsenosides； Liquid chromatographymass spectrometry

（Received 12 March 2015； accepted 2 June 2015）