鄭曉彤，陳薛釵，賀帥，鐘儒剛

（北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京市環(huán)境與病毒腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100124）

癌癥由于其快速增長(zhǎng)的發(fā)病率及高死亡率，已經(jīng)成為人類生命健康的重大威脅，在世界上引起了廣泛的關(guān)注和重視。在人類日常接觸的約6萬種化學(xué)和生物性因子中，除了已被國(guó)際癌癥研究署（IARC）確定的Ⅰ和Ⅱ類致癌物外，還有很多是可疑或未知的人類或動(dòng)物腫瘤啟動(dòng)劑或促癌劑。在過去30年中，全球患腫瘤人數(shù)已經(jīng)翻了一倍，而我國(guó)每年新發(fā)癌癥病例約有三百多萬[1]。因此如何快速篩選并鑒定出這些物質(zhì)的致癌活性，對(duì)預(yù)防癌癥至關(guān)重要。

目前常用的哺乳動(dòng)物致癌實(shí)驗(yàn)有小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗(yàn)、小鼠肺腫瘤誘發(fā)試驗(yàn)、大鼠肝轉(zhuǎn)變?cè)钫T發(fā)試驗(yàn)、雌性SD大鼠乳腺癌誘發(fā)試驗(yàn)等，但是試驗(yàn)周期長(zhǎng)，需利用大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?；诖耍w外細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立為腫瘤病因?qū)W、腫瘤發(fā)病機(jī)制及其防治措施的研究提供了一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃陀辛Φ募夹g(shù)手段[2]。體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)概念最早由Berwald等[3]提出，他們用碳?xì)浠衔锾幚矶扼w小鼠成纖維細(xì)胞，可得到具有癌變性質(zhì)的多層細(xì)胞克隆。1966年，Borek等[4]首先應(yīng)用X 射線成功誘發(fā)二倍體地鼠成纖維細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。1977年，日本學(xué)者Kakunaga[5]首先應(yīng)用甲基硝基亞硝胍（MNNG）和4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）體外誘發(fā)正常婦女口唇皮膚組織二倍體成纖維細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。此時(shí)，體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)開始逐漸形成。正常細(xì)胞經(jīng)過適當(dāng)刺激后發(fā)生細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性的改變，獲得接近于腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)，如呈上皮樣細(xì)胞形態(tài)、排列紊亂、失去方向性、形成交叉和旋渦、失去細(xì)胞密度調(diào)節(jié)作用、染色體核型異常、可以在半固體瓊脂培養(yǎng)基中形成集落等，這種細(xì)胞變化稱為細(xì)胞轉(zhuǎn)化[6]。細(xì)胞是腫瘤發(fā)生的基本單位，研究正常細(xì)胞如何演變成腫瘤細(xì)胞是腫瘤研究中的一個(gè)根本問題。體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化是從細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)水平上研究腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的基本技術(shù)[7]，它能夠快速檢測(cè)有遺傳毒性的化學(xué)品在致癌中的作用，在研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、防止及治療等方面具有重要意義。

1 細(xì)胞轉(zhuǎn)化

體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化非常近似地模擬了動(dòng)物致瘤過程，是眾多方法中較有可能替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，其檢測(cè)效能得到了許多研究者和包括IARC和歐洲替代方法研究中心（ECVAM）等眾多機(jī)構(gòu)關(guān)注。IARC根據(jù)早期數(shù)據(jù)認(rèn)為體外轉(zhuǎn)化與體內(nèi)致癌物間具有很好的相關(guān)性，一致率達(dá)69%～85%。ECVAM對(duì)Balb/c-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的效能參數(shù)進(jìn)行了總結(jié)[8]，表明該方法與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致性為71%，靈敏性和特異性分別為80%和60%，陽性預(yù)測(cè)率為70%，陰性預(yù)測(cè)率為71%。因此，細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)転殍b定人類可能的致癌因子提供非常有價(jià)值的信息。

1.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)化

研究顯示，體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化是一個(gè)多階段的過程：（1）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中致癌的化學(xué)物質(zhì)可誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化；（2）惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可在敏感動(dòng)物體內(nèi)致瘤，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則不能致瘤；（3）在轉(zhuǎn)染活性癌基因的實(shí)驗(yàn)中，正常細(xì)胞向惡性細(xì)胞發(fā)展的不同階段會(huì)表現(xiàn)出多個(gè)不同的表型；（4）促癌劑可增強(qiáng)經(jīng)低濃度啟動(dòng)劑處理過的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化頻率[9]；（5）已在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中確認(rèn)的幾種環(huán)境毒素，有90%以上可在兩階段體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測(cè)中得到陽性結(jié)果[10]。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化的鑒定

在判別細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)中，通常所采用的指標(biāo)有：細(xì)胞形態(tài)學(xué)及其生長(zhǎng)狀況的改變；染色體核形異常；細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶的形態(tài)；半固體瓊脂培養(yǎng)基中形成集落的能力；以及在免疫抑制動(dòng)物或裸鼠體內(nèi)的致瘤能力；此外，還可通過細(xì)胞突變、ConA 凝集反應(yīng)進(jìn)行鑒別。

通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)及其生長(zhǎng)狀況的變化判定細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果主觀性太強(qiáng)，而細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)在致癌物的篩選和早期抗癌藥物的制備中具有重要意義，因此建立快速、簡(jiǎn)便、可靠的體外檢測(cè)方法是毒理學(xué)研究中亟需解決的問題。近年來，從分子水平尋找基因標(biāo)志物判定細(xì)胞轉(zhuǎn)化的終點(diǎn)成為改進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測(cè)方法的一個(gè)方向。Sakai[11]等利用mRNA 差異顯示方法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化時(shí)7個(gè)上調(diào)基因和7個(gè)下調(diào)基因，其中有5個(gè)為促癌劑TPA和崗田酸共有的改變。Maeshima[12]等利用基因芯片技術(shù)，鑒定出22種細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因標(biāo)志物。這22種基因參與細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、抗細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分裂正調(diào)節(jié)?；驑?biāo)志物與細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果具有相關(guān)性，表明以基因標(biāo)志物為基礎(chǔ)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)技術(shù)可能成為促癌物篩選的有效方法。此外王穎[13]等成功建立了Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的H2O2法并實(shí)現(xiàn)了高通量檢測(cè)，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的周期縮短且提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著研究的不斷深入和改進(jìn)，細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)茉谥掳┪锏暮Y選、抗癌新藥的研制和藥物毒理學(xué)的驗(yàn)證等方面發(fā)揮更加重要的作用。

2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化的應(yīng)用

2.1 檢測(cè)物質(zhì)的致癌潛力

細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)具有檢測(cè)各種類型致癌物的潛力，包括基因毒性和非基因毒性致癌物。然而，目前用于評(píng)估的數(shù)據(jù)存在著致癌物和非致癌物數(shù)量不均衡問題，需增加非致癌物檢測(cè)數(shù)據(jù)，以提高特異性值可靠性。另外，還需增加數(shù)據(jù)庫(kù)中被檢測(cè)化學(xué)物的數(shù)量，以使評(píng)估數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方法最初建立的目的是從人類接觸的環(huán)境致癌物中篩選出可能具有致癌活性的物質(zhì)[14]，早期的方法僅能用于啟動(dòng)劑的檢測(cè)，主要為基因毒性致癌物；后來發(fā)展起來的兩階段轉(zhuǎn)化方法使其還可以用于促癌劑的篩選，及藥物對(duì)細(xì)胞的作用等方面。細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)與體內(nèi)腫瘤的形成十分接近，因而它是用來測(cè)試化學(xué)致突變物和致癌物的重要實(shí)驗(yàn)方法。

2.2 檢測(cè)致癌因子間的相互作用

細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)也可被應(yīng)用到多種致癌因子間相互作用檢測(cè)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)某些不具有致癌性，有時(shí)甚至可能具防癌作用的物質(zhì)，在與致癌物相互作用時(shí)反而具協(xié)同促癌作用。Perocco[15]等在檢測(cè)十字花科蔬菜中水田芥甙對(duì)苯并[a]芘（B[a]P）促轉(zhuǎn)化作用影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，具防癌作用的水田芥甙單獨(dú)作用時(shí)并不具促轉(zhuǎn)化作用，但與B[a]P共同作用時(shí)卻能使B[a]P的致癌活性增加約7 倍。具相同作用的還有β-胡蘿卜素，可顯著加強(qiáng)由B[a]P和香煙冷凝物引起的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[16]。王李偉[17]等利用Balb/c 細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法發(fā)現(xiàn)三羥異黃酮也具加強(qiáng)B[a]P引起的細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用。這種協(xié)同作用均發(fā)生在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與B[a]P聯(lián)合作用上，具體機(jī)制可能與細(xì)胞色素氧化酶系激活有關(guān)，該酶系是B[a]P代謝為終致癌物的關(guān)鍵。而已經(jīng)是終致癌物的MCA 對(duì)Balb/c-3T3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用則不受β-胡蘿卜素的影響。

2.3 篩選抑癌物

細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)亦逐漸被用于抑癌物的篩選。Tsuchiya[18]等在促癌階段應(yīng)用抗壞血酸及其衍生物，觀察它們的抑癌作用。結(jié)果表明，抗壞血酸及其衍生物可以顯著抑制TPA、二癸酸佛波酯和腫瘤壞死因子對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用。而β-胡蘿卜素對(duì)苯并[a]芘及香煙氣冷凝物的協(xié)同促轉(zhuǎn)化作用則可被維生素E和α-萘黃酮所抑制[19]。Tsujino[20]等采用Balb/c-3T3細(xì)胞研究新型人工合成無環(huán)視黃醇NIK/333的抗癌作用，發(fā)現(xiàn)其與全反式維甲酸有相似的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)Balb/c-3T3細(xì)胞具有類維生素A 受體，可提高細(xì)胞間隙連接通訊水平。解瑞寧[21]等則利用Balb/c -3T3 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)番茄紅素可以阻止苯并(a)芘誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用，且維生素E 的存在能增強(qiáng)番茄紅素的抗轉(zhuǎn)化作用。Nishikawa[22]等首次報(bào)導(dǎo)了增補(bǔ)鉑納米顆粒的電解還原水可以在促癌階段抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，從而發(fā)現(xiàn)一種新的具有抗癌功能的抗氧化劑。

綜上所述，細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)物質(zhì)致癌活性的重要方法。最近的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)還可用于研究癌癥中microRNA表達(dá)使耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制[23]。細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)在基礎(chǔ)研究中發(fā)揮了重要作用。

3 細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響因素

致癌因子的范圍很廣，化學(xué)因子包括多環(huán)芳烴、烷化劑、金屬化合物及芳香胺類等物質(zhì)，物理因子包括輻射，生物因子有病毒等。致癌物作用后能否引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化率高低和潛伏期的長(zhǎng)短等還要受其它內(nèi)、外因素的影響。

3.1 細(xì)胞系的選擇

細(xì)胞在體外生長(zhǎng)過程中，其生物學(xué)特性要穩(wěn)定，細(xì)胞對(duì)致癌因子的作用反應(yīng)要敏感；細(xì)胞本身自發(fā)轉(zhuǎn)化率要低；對(duì)外界影響細(xì)胞轉(zhuǎn)化的因素要明確；應(yīng)是正常細(xì)胞。目前國(guó)內(nèi)外常用于體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系主要有三種：（1）金黃地鼠胚胎細(xì)胞（GHE）、腎細(xì)胞或乳鼠肺細(xì)胞等；（2）小鼠胚細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、前列腺細(xì)胞等；（3）大鼠胚胎細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞、肝上皮細(xì)胞等。

靶細(xì)胞還可以分為原代培養(yǎng)細(xì)胞和傳代培養(yǎng)細(xì)胞。原代培養(yǎng)細(xì)胞的代表是敘利亞地鼠的胚胎成纖維細(xì)胞（SHE）。該細(xì)胞容易制備和培養(yǎng)，自發(fā)轉(zhuǎn)化率較低，轉(zhuǎn)化后容易識(shí)別并能以定量的方式獲得數(shù)字結(jié)果。此外，它的測(cè)試周期較短，具有代謝多種化學(xué)致癌物，使其成為終末致癌物的能力，比較適于檢測(cè)環(huán)境中的各種可疑致癌物。但亦有研究表明，該系統(tǒng)對(duì)環(huán)境中的易變因素過于敏感，如容易受到小牛血清的不同來源和特定胚胎細(xì)胞池的影響[24,25]；另外，它的細(xì)胞群是異質(zhì)的，在無飼細(xì)胞層的條件下，克隆形成率較低。傳代細(xì)胞系是原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后獲得的細(xì)胞系，也可細(xì)分為有限細(xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系[26]。常用的Balb/c-3T3、 C3H10T1/2 和BHK-21均為連續(xù)細(xì)胞系。

傳代細(xì)胞系較原代培養(yǎng)細(xì)胞系具有細(xì)胞群落穩(wěn)定性高，試驗(yàn)重復(fù)性良好，劑量反應(yīng)關(guān)系明顯等特點(diǎn)[27]，常用于實(shí)驗(yàn)研究。由于人類癌癥約70% 來自上皮細(xì)胞，因此以上皮細(xì)胞作為靶細(xì)胞更具備實(shí)際意義。但上皮細(xì)胞建系困難，而且轉(zhuǎn)化細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)不如成纖維細(xì)胞那樣明確，因此對(duì)于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)體系的優(yōu)化尤為迫切[28]。

3.2 其它影響因素

細(xì)胞轉(zhuǎn)化還要受其它因素的制約：（1）受細(xì)胞來源的影響。與供體的種屬有關(guān)，小鼠、金黃地鼠胚胎細(xì)胞對(duì)化學(xué)致癌物致癌作用很敏感，而人的成纖維細(xì)胞則不敏感[29]；（2）與細(xì)胞性質(zhì)相關(guān)。細(xì)胞分化程度與轉(zhuǎn)化潛伏期長(zhǎng)短呈負(fù)相關(guān)，如妊娠12天的鼠胚細(xì)胞和20個(gè)月月齡金黃地鼠皮膚成纖維細(xì)胞誘發(fā)轉(zhuǎn)化的潛伏期分別為20.3和10.8 個(gè)細(xì)胞群體倍增時(shí)間（TD）。間質(zhì)細(xì)胞較上皮細(xì)胞敏感，后者細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低，潛伏期長(zhǎng)[30,31]，可長(zhǎng)達(dá)4 個(gè)月或更長(zhǎng)；（3）受培養(yǎng)條件變化的影響。培養(yǎng)基內(nèi)血清濃度降低，則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低。在有滋養(yǎng)層細(xì)胞存在時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)化率提高。培養(yǎng)溫度降低(如由37℃ 降到32℃)、加入兩性霉素和長(zhǎng)期缺氧則可使己轉(zhuǎn)化的細(xì)胞失去轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)[32]；（4）與化合物對(duì)細(xì)胞作用的方式相關(guān)。多環(huán)芳香族碳?xì)浠衔锖芸炫c靶細(xì)胞DNA 、RNA 和蛋白質(zhì)結(jié)合，特別是與細(xì)胞核DNA 的結(jié)合[33]。DNA鏈結(jié)構(gòu)受損，引起細(xì)胞遺傳信息改變，細(xì)胞首先發(fā)生突變，進(jìn)一步染色體畸變和新型核組出現(xiàn)。在致癌物作用下，在前5～10 代細(xì)胞可發(fā)生突變，傳代至50～150個(gè)TD后能在軟瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、增殖，形成細(xì)胞集落的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在動(dòng)物接種后可達(dá)100%惡性腫瘤形成率。胞漿內(nèi)RNA、蛋白質(zhì)等的改變?cè)诩?xì)胞轉(zhuǎn)化方面不起關(guān)鍵作用。如用3H-TdR和氖一尿嘧啶核苷（3H-U）分別摻入到胞核DNA和胞漿RNA 、蛋白質(zhì)內(nèi)，只有3H-TdR才能引起細(xì)胞突變和轉(zhuǎn)化[34]。

4 結(jié)語

細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)作為篩選致癌物一種有效方法已被廣泛地應(yīng)用，然而構(gòu)建更加穩(wěn)定敏感的細(xì)胞系，客觀和精準(zhǔn)的檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)手段仍需進(jìn)一步研究。人體細(xì)胞是最為理想的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)靶細(xì)胞，然人體細(xì)胞化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化最終形成癌細(xì)胞是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，無法用常規(guī)方法篩選。因此在這方面進(jìn)行更深入地研究將有助于學(xué)者發(fā)現(xiàn)未知的潛在致癌因子，進(jìn)一步探知癌癥的致病機(jī)理，為藥物毒性的檢測(cè)提供一個(gè)強(qiáng)有力的手段。隨著分子生物學(xué)與生物化學(xué)、遺傳學(xué)及免疫學(xué)等學(xué)科的交叉發(fā)展，細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)將在研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、防止及治療等方面發(fā)揮重要作用。

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