李貴正+涂國全+劉紀(jì)臣+李新柱

摘 要：經(jīng)Ashby培養(yǎng)基富集培養(yǎng)及平板分離，從金正大污水處理廠的活性污泥中分離到8株自生固氮菌。經(jīng)蘇丹黑染色初篩獲得3株產(chǎn)PHB菌株。以菌株產(chǎn)生的PHB顆粒大小、PHB占細(xì)胞干重的含量及菌落生長速度為指標(biāo)，獲得最佳菌株N1。通過《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》第九版初步鑒定此菌株為圓褐固氮菌（Azotobacter ?chroococcum）。

關(guān)鍵詞：固氮菌;PHB;初篩;復(fù)篩;圓褐固氮菌

中圖分類號：Q939.11+3 ?文獻(xiàn)標(biāo)識號：A ?文章編號：1001-4942（2015）06-0049-03

Screening and Preliminary Identification for a Strain of

Nitrogen-Fixing Bacterium Producing PHB

Li Guizheng1， Tu Guoquan2， Liu Jichen1， Li Xinzhu1

（1.Kingenta Ecological Engineering Group Co.， Ltd.， Linshu 276700， China;

2. Department of Bioscience and Bioengineering， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045，China）

Abstract Eight nitrogen-fixing bacteria were isolated from ?the activated sludge from sewage farm of Kingenta by enriching culture and isolating in Ashby medium. Three strains producing PHB were obtained by Suda black staining. Strain N1 was regarded as the best one by the PHB diameter， content of PHB account for cell dry weight and the colony growth rate. Strain N1 was preliminary identified as Azotobacter chroococcum.

Key words Azotobacter;PHB; Preliminary screening; Secondary ?screening; Azotobacter chroococcum

隨著人們環(huán)保意識的日益提高，研究可降解塑料成了當(dāng)務(wù)之急，尋找可降解的替代品勢在必行。聚β-羥基丁酸（poly - β-hydroxybutyric acid ， PHB） 是一種生物可降解的熱塑性塑料，其分解產(chǎn)物可完全降解為二氧化碳和水，對環(huán)境無任何污染。利用這一特性，世界各國都競相開發(fā)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、無環(huán)境污染塑料制品等方面的用途，主要是人體可吸收醫(yī)用材料、緩控釋微球或微膠囊、一次性塑料制品等[1～3]。我國實(shí)行禁塑令之后，作為化工塑料的替代品將會幫助我國解決目前日益嚴(yán)重的“白色污染”問題，應(yīng)用前景廣闊。

產(chǎn)生PHB的細(xì)菌包括光能自養(yǎng)、化能自養(yǎng)和異養(yǎng)菌約65屬300多種。目前用于PHB研究和生產(chǎn)的菌種主要有真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes eutrophus）、肥大產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes latus）、自養(yǎng)黃桿菌（Xanthobacter autotrophicus）、巨大芽孢桿菌（B. megaterium）、棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）、拜氏固氮菌（A. beijerinckii）、極端嗜鹽菌（Haloferax mediterranei）、球形紅桿菌（Rhodobacter sphaeroides）以及豚鼠氣單胞菌（Aeromanas caviae）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas. putida）、扭脫原單胞菌（Protomonas ectorguens）、紅色紅球菌（Rhodococcus ruber）等[4]。其中PHB自然累積量比較多的細(xì)菌有：產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、甲基營養(yǎng)菌（Methylotrophs）、固氮菌屬（Azotobaeter）、紅螺屬（Rhodospillum）。真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌和固氮菌屬是研究和應(yīng)用較多的PHB生產(chǎn)菌種。董兆麟和黃建新[5]從野外采回土樣進(jìn)行菌種分離，得到一株編號為B8的菌株，經(jīng)初步鑒定為固氮菌，菌株產(chǎn)PHB的量達(dá)細(xì)胞干重的41.5%。本試驗(yàn)從活性污泥中分離、純化、篩選出一株高產(chǎn)PHB的固氮菌，以期為利用廉價(jià)材料進(jìn)行發(fā)酵、探索普適化生產(chǎn)PHB的途徑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 金正大污水處理廠采集的活性污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)用Ashby液體培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)用Ashby固體培養(yǎng)基（加2%瓊脂）。Ashby培養(yǎng)基配方：甘露醇1.0 g， KH2PO4 0.02 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，NaCl 0.02 g，CaSO4·H2O 0.02 g，CaCO3 0.5 g，蒸餾水 100 mL，pH 7.0～7.2;0.05 Mpa壓力，113℃，滅菌30 min。

1.1.3 主要藥品和試劑 蘇丹黑，番紅，NaClO，二甲苯，丙酮，乙醇，氯仿，十二烷基磺酸鈉（SDS）。

1.1.4 主要儀器 顯微鏡，學(xué)生直尺，目鏡測微尺，鏡臺測微尺，G25搖床（USA），電子分析天平（瑞士梅特勒托利多），高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。endprint

1.2 方法

1.2.1 自生固氮菌的獲得 ①富集培養(yǎng)方法：Ashby無氮培養(yǎng)液50 mL裝于250 mL三角瓶中，滅菌后接種活性污泥一環(huán)，100～150 r/min搖床培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48 h[6～7]。靜止培養(yǎng)1～2 h，取5 mL上清液接種到滅菌的Ashby液體培養(yǎng)基中，100～150 r/min搖床培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48 h。以上操作步驟重復(fù)3次。

②純化分離方法：采用涂布法獲得單菌落，然后采用平板劃線法進(jìn)一步純化。重復(fù)操作直至獲得純培養(yǎng)。

③菌株純度鑒定方法：37℃培養(yǎng)48 h，平板上不出現(xiàn)雜菌菌落;菌株在平板上形成均具特征性的單菌落;鏡檢無異樣細(xì)胞發(fā)現(xiàn)。

1.2.2 產(chǎn)PHB固氮菌初篩 蘇丹黑染色法判斷菌株是否產(chǎn)生PHB。菌體涂片，風(fēng)干，熱固定;用0.3%蘇丹黑染色5～15 min，倒去染液，風(fēng)干;二甲苯浸泡10 s，輕洗玻片數(shù)次直至液體不再脫色，風(fēng)干;番紅染色10 s，清洗、風(fēng)干。根據(jù)染色結(jié)果判斷，PHB顆粒呈藍(lán)黑色，細(xì)胞質(zhì)為紅色。

1.2.3 產(chǎn)PHB固氮菌復(fù)篩 經(jīng)初篩的產(chǎn)PHB固氮菌株37℃培養(yǎng)48 h，測定PHB顆粒直徑、菌落直徑，培養(yǎng)60 h時(shí)測定PHB占細(xì)胞干重的百分比，進(jìn)行復(fù)篩。

①PHB顆粒大小測定：顯微鏡下用目鏡測微尺進(jìn)行測量并計(jì)算。

②菌落大小測定：采用“十”字交叉法測量同一菌落直徑2次，取平均值。

③PHB含量測定： 取200 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心 20 min，菌體用蒸餾水洗滌后再離心。離心后的菌體懸浮于42.5 mL蒸餾水中，加入10 mL 100 g/L的SDS，在水浴中攪拌處理10 min，然后再加入5 mL NaClO溶液，繼續(xù)攪拌處理5 min。處理后的菌液4 000 r/min離心20 min，沉淀物用蒸餾水和丙酮各洗滌一次， 60～70℃下烘干。干品用15 mL氯仿60℃抽提60 min，然后過濾。濾液加熱蒸發(fā)，除去氯仿，析出PHB。再用丙酮和乙醇各洗滌一次，60℃烘干，得到白色粉末或薄膜狀PHB[8～11]。采用Lemoigue 重量分析法[12]測定PHB占細(xì)胞干重的百分比。

1.2.4 菌株鑒定法 通過觀察細(xì)胞形態(tài)、菌落培養(yǎng)特征、莢膜有無、革蘭氏染色等，參照《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》第九版進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 富集培養(yǎng)后分離純化結(jié)果

獲得自生固氮菌株8株，7株為球菌，1株為短桿菌。

2.2 初篩結(jié)果

蘇丹黑染色鑒定3株球菌產(chǎn)生PHB，分別命名為菌株N1、菌株N2和菌株N3，見圖1。

圖1 PHB染色結(jié)果（10×100）

2.3 復(fù)篩結(jié)果

3株固氮菌株培養(yǎng)48 h產(chǎn)PHB顆粒大小、菌落直徑大小及培養(yǎng)60 h后產(chǎn)PHB含量均為菌株N1最大，菌株N2次之，菌株N3最小，菌株N1被確定為最佳菌株。

表1 3株固氮菌產(chǎn)PHB顆粒直徑、菌落

直徑及PHB含量

菌株

編號 產(chǎn)PHB顆粒

直徑（μm） 菌落直徑

（cm） PHB占細(xì)胞干重

百分比（%）

N1 1.8 2.8 37.3

N2 1.5 2.1 34.9

N3 1.3 1.9 28.4

2.4 菌株N1初步鑒定結(jié)果

2.4.1 細(xì)胞顯微鏡下觀察結(jié)果 在顯微鏡下細(xì)胞呈大卵圓形，培養(yǎng)2 d后，常成對出現(xiàn)，呈“8”字型排列，菌體直徑約為2～5 μm。

2.4.2 菌落培養(yǎng)特征 Ashby無氮平板培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后，菌落直徑約0.88～1.66 cm，菌落由白色逐漸變?yōu)楹稚?30 h后菌落顏色逐漸變成黃褐色;菌落表面比較濕潤，菌體邊緣近似橢圓形，表面隆起呈花紋狀，不透明（圖2）。

注：96 h菌落為放大1.5倍。

圖2 自生固氮菌36、96 h菌落

2.4.3 莢膜染色結(jié)果 菌株N1莢膜負(fù)染色結(jié)果如圖3，可見具較厚的莢膜層。

2.4.4 革蘭氏染色結(jié)果 革蘭氏染色后菌株N1菌體呈紅色，為革蘭氏陰性菌。

2.4.5 菌株鑒定結(jié)果 參照《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》第九版對菌株進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特征等方面的鑒定，初步鑒定該菌為圓褐固氮菌（Azotobacter ?chroococcum）。

圖3 莢膜染色（10×40）

3 小結(jié)與討論

3.1 本試驗(yàn)將分離純化與高產(chǎn)PHB菌株的篩選結(jié)合起來，以菌株所產(chǎn)PHB顆粒大小、菌落生長速度和所產(chǎn)PHB占細(xì)胞干重含量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，選出了最佳菌株N1。

3.2 高產(chǎn)PHB菌株N1的初步研究表明：該菌生長速度快，產(chǎn)生的PHB顆粒幾乎達(dá)到菌體體積的2/3，含量可達(dá)菌體干重的37%以上。如經(jīng)誘變和培養(yǎng)基優(yōu)化，可成為極有前途的生產(chǎn)菌種，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 經(jīng)過生物學(xué)特征研究后，初步鑒定此菌株為圓褐固氮菌（Azotobacter ?chroococcum）。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 陳琦，黃和蓉，易祖華.微生物合成生物降解塑料研究現(xiàn)狀與展望[J].微生物學(xué)通報(bào)，1994，21（5）：297-303.

[2] 祁紅兵，曹國清.聚-β-羥基丁酸（PHB）的研究及應(yīng)用前景[J].信陽師范學(xué)院：自然科學(xué)版，2005，18（1）：121-124.

[3] 洪葵， 陳國強(qiáng)， 黃為一， 等. 羥基丁酸及中鏈羥基脂肪酸共聚物的微生物合成[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，1998，25（2）：110-113.

[4] 劉春，張小凡.PHB在生產(chǎn)可降解塑料方面的應(yīng)用及其微生物累積的研究進(jìn)展[J].塑料工業(yè)，2005，33（8）：2-3.

[5] 董兆麟，黃建新.高產(chǎn)聚-β-羥基丁酸菌的分離和檢測 [J].西北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1996，26（2）：165-166.

[6] 薛林貴.一株聚-β-羥基丁酸的分離和研究[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，2（4）：101-102.

[7] 酈和生，張春元. 生產(chǎn)聚羥基丁酸酯（PHB）的菌種選育及發(fā)酵條件[J]. 石化技術(shù)，1997，4（4）：212-215.

[8] 潘貴全，盛青，秦杰.次氯酸鈉/氯仿混合液提取PHA的初步研究[J].化工冶金，1999，20（3）：286-289.

[9] 尹進(jìn)，于慧敏，李紅旗，等.用十二烷基磺酸鈉純化重組大腸桿菌中的聚羥基丁酸酯[J].化工學(xué)報(bào)，1998，49（3）： 353-357.

[10]陳接鋒，許旭萍，佘晨興，等.合成聚p一羥基丁酸（PHB）鞘細(xì)菌的分離、鑒定與篩選[J].工業(yè)微生物，2003，33 （4）：1-4.

[11]尹進(jìn)，于慧敏，李紅旗，等.用SDS—NaClO從重組大腸桿菌中分離聚羥基丁酸酯[J].生物工程學(xué)報(bào)，1998，14（3）：342-344.

[12]Ostle A G，Holt J G.Nile Blue A as a fluorescent stain for poly-β-hydroxybulyric acid [J].Appl. Envinm. Microbial.，1982，44：238-241.endprint