席　強(qiáng)，崔　瑞，金　光，郭永明

·實(shí)驗(yàn)研究·

穴位局部TLR4在針刺后穴位局部炎癥反應(yīng)中作用的初步研究*

席強(qiáng)，崔瑞，金光，郭永明

（天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)針灸研究中心，天津300193）

［目的］探討穴位局部TOLL樣受體4（TLR4）在針刺后穴位局部炎癥反應(yīng)中的作用。［方法］將80只健康大鼠隨機(jī)分為針刺組和空白對(duì)照組，每組各40只。每組的40只大鼠再隨機(jī)分8個(gè)時(shí)點(diǎn)（即刻、15m in、30min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h），每個(gè)時(shí)點(diǎn)5只。采用ELISA法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)穴區(qū)皮膚肌肉組織中TLR4、高遷移率族蛋白（HMGB1）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的濃度。［結(jié)果］空白對(duì)照組，各指標(biāo)濃度在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯變化；針刺組針刺后TLR4、HMGB1、IL-6、TNF-α濃度升高，而IL-1β濃度無(wú)明顯變化。對(duì)每只大鼠穴位局部TLR4與其他指標(biāo)濃度的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，針刺后HMGB1、TNF-α與TLR4的相關(guān)性增強(qiáng)，IL-6與TLR4的相關(guān)性減弱，IL-1β與TLR4的相關(guān)性針刺前后則無(wú)明顯變化。［結(jié)論］穴位局部TLR4介導(dǎo)的通路可能是針刺后穴位局部炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的通路之一。

針刺；穴位；TOLL樣受體4；炎癥反應(yīng)

針刺作為一種物理刺激，其在針刺穴位局部必然引起損傷［1］，由此引發(fā)的神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫互聯(lián)反應(yīng)是針刺效應(yīng)啟動(dòng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，因此圍繞針刺局部展開(kāi)一些基礎(chǔ)研究對(duì)于揭示針刺作用規(guī)律及特點(diǎn)是至關(guān)重要的［2］。高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種重要的損傷相關(guān)模式（DAMP）分子，組織損傷時(shí)HMGB1可由壞死的細(xì)胞被動(dòng)釋放和（或）激活的免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌至細(xì)胞外，作為內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)參與全身或局部的炎癥反應(yīng)。TOLL樣受體4（TLR4）是跨膜信號(hào)傳導(dǎo)受體，在人類所有細(xì)胞中表達(dá)，不僅可識(shí)別外源性病原相關(guān)分子模式，還可識(shí)別DAMP，與其配體結(jié)合后介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）通路是機(jī)體內(nèi)重要的炎癥反應(yīng)通路之一。前期研究發(fā)現(xiàn)針刺引起的局部炎癥反應(yīng)是針效產(chǎn)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)之一［3］。因此，本研究對(duì)針刺后穴位局部HMGB1、TLR4及相關(guān)炎性因子白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的濃度變化進(jìn)行研究，以期為穴位局部TLR4可能參與針刺后穴位局部炎癥反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選用SPF級(jí)健康成年Wistar大鼠80只，雌雄不拘，體質(zhì)量（200±20）g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號(hào)：SCXK-（軍）2009-003，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)要求。按隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為空白對(duì)照組和針刺組，每組按照干預(yù)后取材時(shí)間點(diǎn)的不同，隨機(jī)分為8個(gè)時(shí)點(diǎn)，分別為干預(yù)后即刻、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h組，每個(gè)時(shí)點(diǎn)5只。

1.2實(shí)驗(yàn)材料酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（武漢華美生物科技有限公司），低溫低速離心機(jī)（美國(guó)，MICRROLTR）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（芬蘭，Thermo FisherMK-3）、針刺手法參數(shù)測(cè)定儀（上海，ATPⅡ型）。

1.3干預(yù)方法針刺組針刺大鼠右側(cè)足三里穴，深度約為7 mm（針灸針已固定進(jìn)針深度），行提插平補(bǔ)平瀉法，頻率為每分鐘120次，行針2min。針刺手法于針刺手法參數(shù)測(cè)定儀上訓(xùn)練，待手法操作波形示意圖持續(xù)穩(wěn)定后方可行針刺干預(yù)，見(jiàn)圖1?？瞻讓?duì)照組采用同針刺組完全相同的大鼠固定方法。

1.4標(biāo)本制備分別取各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)穴周大小為0.8 cm×0.8 cm×0.6 cm的皮膚肌肉組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，放入-20℃的冰箱中保存，待樣本收集完后集中勻漿和離心。取100mg組織，用1×PBS洗去血污，剪成小塊放入組織研磨器（勻漿管）中，加入1mL 1×PBS，制成勻漿，然后置于-20℃過(guò)夜。經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融2次處理破壞細(xì)胞膜后，將組織勻漿于2～8℃5 000×g離心5min取上清。取適量上清液立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，或?qū)⑸锨宸盅b保存于-20℃或-80℃，解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。

1.5ELISA法檢測(cè)采用ELISA法對(duì)足三里穴區(qū)皮膚肌肉組織勻漿中的各指標(biāo)含量進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間同時(shí)間點(diǎn)的比較，若符合正態(tài)分布及方差齊，則采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若偏態(tài)分布或方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)比較采用單因素方差分析，TLR4與其他各指標(biāo)進(jìn)行一元線性相關(guān)與回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　針刺手法參數(shù)測(cè)定儀和每分鐘120次提插手法操作波形示意圖Fig.1　Acupuncture technique parameter tester and the wavesofshifting-thrustingacupuncturemanipulation with the frequency of 120 times perm inute

2　結(jié)果

2.1穴位局部各指標(biāo)濃度隨時(shí)間的變化

2.1.1穴位局部HMGB1濃度隨時(shí)間的變化空白對(duì)照組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示正常生理情況下，穴位局部的HMGB-1濃度比較穩(wěn)定，固定對(duì)其無(wú)明顯影響；針刺組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但針刺后8 h較其他各時(shí)間點(diǎn)有明顯升高趨勢(shì)；針刺后8 h較空白對(duì)照組8 h有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示針刺可使穴位局部的HMGB1濃度發(fā)生變化，且在所觀察的時(shí)間段內(nèi)于針刺后8 h達(dá)到高峰。見(jiàn)表1。

表1　不同時(shí)間點(diǎn)HMGB1濃度變化（±s）Tab.1　The changesof HMGB1 concentration atdifferent tim epoints（±s）ng/mL

表1　不同時(shí)間點(diǎn)HMGB1濃度變化（±s）Tab.1　The changesof HMGB1 concentration atdifferent tim epoints（±s）ng/mL

注：與空白對(duì)照組8 h比較，*P＜0.05。

分組即刻15min 30min 01 h 02 h 04 h 08 h 24 h n55555555空白對(duì)照組　　針刺組1 059.51±298.68　1 096.07±0 396.55 1 010.74±302.61　1 237.45±0 358.78 823.53±174.40　1 000.87±0 245.58 1 376.23±499.09　1 297.45±0 430.23 1 534.96±664.42　1 013.71±0 330.72 993.70±217.46　1 279.33±1 095.56 748.60±250.03　1 983.85±0 996.59* 1 017.43±370.45　1 101.99±0 535.99

2.1.2穴位局部TLR4濃度隨時(shí)間的變化空白對(duì)照組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示正常生理情況下，穴位局部的TLR4濃度比較穩(wěn)定，固定對(duì)其無(wú)明顯影響。針刺組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但針刺后8 h較其他各時(shí)間點(diǎn)有明顯升高趨勢(shì)；針刺后8 h較空白對(duì)照組8 h有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示針刺可使穴位局部的TLR4濃度發(fā)生變化，且在所觀察的時(shí)間段內(nèi)于針刺后8 h達(dá)到高峰。見(jiàn)表2。

表2　不同時(shí)間點(diǎn)TLR 4濃度變化（±s）Tab.2　The changesof TLR4 concentration at different time points（±s）ng/m L

表2　不同時(shí)間點(diǎn)TLR 4濃度變化（±s）Tab.2　The changesof TLR4 concentration at different time points（±s）ng/m L

注：與空白對(duì)照組8 h相比，*P＜0.05。

分組即刻15min 30min 01 h 02 h 04 h 08 h 24 h n55555555空白對(duì)照組　　針刺組11.31±2.29　10.78±3.29 8.57±3.41　12.86±1.76 8.81±2.60　10.17±3.53 11.47±6.59　12.40±5.03 11.62±6.87　10.61±3.76 10.60±2.48　9.30±6.51 6.90±2.66　14.34±5.52* 9.37±4.72　10.29±5.66

2.1.3穴位局部IL-1β濃度隨時(shí)間的變化空白對(duì)照組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示正常生理情況下，穴位局部的IL-1β濃度比較穩(wěn)定，固定對(duì)其無(wú)明顯影響。針刺組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。兩組間對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示針刺對(duì)穴位局部IL-1β濃度無(wú)明顯影響。見(jiàn)表3。

2.1.4穴位局部IL-6濃度隨時(shí)間的變化空白對(duì)照組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示正常生理情況下，穴位局部的IL-6濃度比較穩(wěn)定，固定對(duì)其無(wú)明顯影響；針刺組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但針刺后15min、8 h較其他各時(shí)間點(diǎn)有升高趨勢(shì)；兩組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但針刺后15min、8 h較空白即刻、15min、30min、8 h、24 h有升高趨勢(shì)，提示針刺后穴位局部IL-6濃度可發(fā)生變化，且在所觀察的時(shí)間段內(nèi)于針刺后15min、8 h達(dá)到高峰。見(jiàn)表4。

表3　不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β濃度變化（±s）Tab.3　The changesof IL-1βconcentration at different tim e points（±s）ng/mL

表3　不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β濃度變化（±s）Tab.3　The changesof IL-1βconcentration at different tim e points（±s）ng/mL

分組即刻15min 30min 01 h 02 h 04 h 08 h 24 h n55555555空白對(duì)照組　　針刺組255.29±98.94　254.78±58.10 299.04±171.38　430.68±147.07 195.61±35.09　277.75±123.23 508.33±368.59　498.75±336.01 538.50±536.58　292.51±110.65 250.73±93.38　328.92±393.55 265.15±203.20　284.54±72.53 292.56±191.49　306.79±223.08

表4　不同時(shí)間點(diǎn)IL－6濃度變化（±s）Tab.4　The changesof IL-6 concentration atdifferent tim e points（±s）ng/mL

表4　不同時(shí)間點(diǎn)IL－6濃度變化（±s）Tab.4　The changesof IL-6 concentration atdifferent tim e points（±s）ng/mL

分組即刻15min 30min 01 h 02 h 04 h 08 h 24 h n55555555空白對(duì)照組　　針刺組2.67±0.53　2.98±0.74 2.31±0.70　4.15±1.52 2.47±0.28　3.55±0.98 3.45±1.19　3.29±0.94 2.63±1.22　3.22±1.01 2.65±0.68　2.75±1.66 2.30±0.71　4.28±1.59 2.52±0.84　2.79±0.98

2.1.5穴位局部TNF-α濃度隨時(shí)間的變化空白對(duì)照組僅1 h組與15min組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其余各時(shí)間點(diǎn)之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示正常生理情況下，穴位局部的TNF-α濃度可維持在一定范圍內(nèi)；針刺組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；但針刺后15min較空白對(duì)照組15min有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），針刺后8 h較空白對(duì)照組8 h有升高趨勢(shì)（P＜0.05），提示針刺后穴位局部TNF-α濃度可發(fā)生變化，且在所觀察的時(shí)間段內(nèi)，于針刺后15min、8 h達(dá)到高峰。見(jiàn)表5。

表5　不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α濃度變化（±s）Tab.5　The changesof TNF-αconcentration atdifferent tim e points（±s）ng/m L

表5　不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α濃度變化（±s）Tab.5　The changesof TNF-αconcentration atdifferent tim e points（±s）ng/m L

注：與空白15m in組相比，*P＜0.05。

分組即刻15min 30min 01 h 02 h 04 h 08 h 24 h n55555555空白對(duì)照組　　針刺組104.43±37.37　120.78±65.11 63.34±45.79　137.42±24.65* 92.46±46.26　93.12±36.82 124.48±54.20*　117.34±45.71 85.05±77.45　85.54±47.17 113.81±27.48　93.74±74.37 75.49±41.50　131.75±54.06* 93.18±51.68　94.12±61.47

2.2TLR4與各指標(biāo)相關(guān)性分析

2.2.1TLR4與HMGB1相關(guān)性分析空白對(duì)照組和針刺組穴位局部HMGB1與TLR4的表達(dá)均呈正相關(guān)，而且針刺后穴位局部HMGB1與TLR4的相關(guān)性確定系數(shù)增大（回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)圖2），說(shuō)明針刺后穴位局部HMGB1的表達(dá)可能與TLR4關(guān)系密切。

圖2　空白對(duì)照組和針刺組HMGB1與TLR4濃度相關(guān)關(guān)系圖Fig.2　The concentration affinity d iagram betw een HMGB1 and TLR4 in controlgroup and acupuncturegroup

2.2.2TLR4與IL-1β相關(guān)性分析空白對(duì)照組和針刺組穴位局部IL-1β與TLR4的表達(dá)均呈正相關(guān)，針刺后穴位局部IL-1β與TLR4的相關(guān)性確定系數(shù)基本不變（回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)圖3），提示針刺后穴位局部IL-1β的表達(dá)與TLR4關(guān)系不明顯。

圖3　空白對(duì)照組和針刺組IL-1β與TLR4濃度相關(guān)關(guān)系圖Fig.3　The concentration affinity diagram betw een IL-1β and TLR4 in controlgroup and acupuncturegroup

2.2.3TLR4與IL-6相關(guān)性分析空白對(duì)照組和針刺組穴位局部IL-6與TLR4的表達(dá)均呈正相關(guān)，針刺后穴位局部IL-6與TLR4的相關(guān)性確定系數(shù)減?。ɑ貧w方程及相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)圖4），提示針刺后穴位局部IL-6的表達(dá)與TLR4之間缺乏直接聯(lián)系。

圖4　空白對(duì)照組和針刺組IL-6與TLR4濃度相關(guān)關(guān)系圖Fig.4　The concentration affinity diagram between IL-6 and TLR4 in controlgroup and acupuncturegroup

2.2.4TLR4與TNF-α相關(guān)性分析空白對(duì)照組和針刺組穴位局部TNF-α與TLR4的表達(dá)均呈正相關(guān)，而且針刺后穴位局部TNF-α與TLR4的相關(guān)性確定系數(shù)增大（回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)圖5），說(shuō)明針刺后穴位局部TNF-α的表達(dá)可能與TLR4關(guān)系密切。

圖5　空白對(duì)照組和針刺組TNF-α與TLR4濃度相關(guān)關(guān)系圖Fig.5　The concentration affinity diagram between TNF-α and TLR4 in controlgroup and acupuncturegroup

3　討論

前期研究發(fā)現(xiàn)［4］針刺后穴區(qū)肌肉組織可出現(xiàn)肌纖維斷裂，且斷裂的細(xì)纖維間隙有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，為針刺后穴位局部可產(chǎn)生炎癥反應(yīng)提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。此外，張迪等［5］研究發(fā)現(xiàn)針刺可促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、緩激肽等物質(zhì)，這些物質(zhì)可擴(kuò)張毛細(xì)血管及微靜脈，使血管內(nèi)皮基底膜暴露，血管通透性增強(qiáng)，炎性介質(zhì)滲出，為針刺后穴位局部可產(chǎn)生炎癥反應(yīng)提供了病理學(xué)依據(jù)。調(diào)控穴位局部肥大細(xì)胞、相關(guān)活性物質(zhì)對(duì)針刺效應(yīng)有一定的影響，即調(diào)控炎癥反應(yīng)的上游環(huán)節(jié)會(huì)影響到針刺效應(yīng)。因此本研究圍繞TLR4的可能上游信號(hào)分子（HMGB1）及下游事件促炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達(dá)展開(kāi)，以初步明確TLR4在針刺引起局部炎癥反應(yīng)中的作用。

HMGB1作為重要的晚期炎性因子（血液延遲表達(dá)6-32 h［6］），與TNF-α、IL-1β等早期炎性因子相互誘生，不斷放大炎性信號(hào)，造成炎癥失控遷延，在風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性肝病、惡性腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中發(fā)揮重要作用。但是新近的研究發(fā)現(xiàn)HMGB1還具有組織損傷因子作用，作為核蛋白，在多數(shù)組織細(xì)胞內(nèi)含量豐富，而細(xì)胞一旦受損傷，膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞就會(huì)以單純擴(kuò)散的方式釋放HMGB1，釋放進(jìn)入細(xì)胞間隙的HMGB1可刺激樹(shù)突細(xì)胞的成熟、增殖，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，使機(jī)體對(duì)已經(jīng)發(fā)生的損傷產(chǎn)生防御反應(yīng)和炎性反應(yīng)。HMGB1還是致炎細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)中心環(huán)節(jié)，不僅能促使TNF-α、IL-1β等表達(dá)，還能激活ERK激酶、P38MAPK激酶、JNK激酶并促使核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）發(fā)生核移位［7］。因此，HMGB1在組織損傷后適當(dāng)?shù)臅r(shí)間釋放出來(lái)，可能參與炎癥過(guò)程中免疫和內(nèi)分泌反應(yīng)的調(diào)節(jié)［8］。針刺后穴位局部HMGB1的表達(dá)及升高可能啟動(dòng)了穴位局部炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展和自我修復(fù)的過(guò)程，該過(guò)程可能與TLR4密切相關(guān)。

已經(jīng)證實(shí)很多受體在HMGB1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用，包括晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和某些TOLL樣受體家族成員。研究發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4可與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分泌的HMGB1結(jié)合，促使NF-κB活化，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，提示TLR2和TLR4可能是HMGB1的潛在受體［9］。而且不同TOLL樣受體介導(dǎo)產(chǎn)生的炎性因子有所不同，孫立［10］觀察HMGB1誘導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻笫罂莘窦?xì)胞（KCs）促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的分子機(jī)制，TLR4在HMGB1誘導(dǎo)KCs表達(dá)TNF-α的過(guò)程中起到更重要的作用，而HMGB1誘導(dǎo)KCs表達(dá)IL-1β主要依靠TLR2介導(dǎo)。TLR2和TLR4在燒傷后KCs中HMGB1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的細(xì)胞因子釋放過(guò)程中發(fā)揮著不同作用。本研究初步發(fā)現(xiàn)，TLR4在針刺誘導(dǎo)穴位局部TNF-α表達(dá)的過(guò)程中關(guān)系密切，而針刺誘導(dǎo)穴位局部IL-6的表達(dá)可能依賴別的途徑。

從穴位刺激到機(jī)體效應(yīng)，兩者之間并不是直線性聯(lián)系，而是由體內(nèi)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)介導(dǎo)的?，F(xiàn)代研究也認(rèn)為，生物體作為一個(gè)開(kāi)放的復(fù)雜系統(tǒng)，是由無(wú)數(shù)個(gè)大小網(wǎng)絡(luò)相互聯(lián)系、整合而形成的［11］，針刺穴位局部就存在一個(gè)能將針刺物理信息轉(zhuǎn)化為生物信息的啟動(dòng)網(wǎng)絡(luò)，HMGB1、TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α均是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要成員，具有廣泛的生物學(xué)活性，是機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的重要因子［12］。局部低濃度的IL-1β主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，它可直接產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細(xì)胞而在血管炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［13］。IL-6作為一種多效性因子是宿主對(duì)感染和組織損傷所引起反應(yīng)的主要介質(zhì)，同時(shí)也是參與炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫功能的重要細(xì)胞因子之一［14-16］。在炎癥反應(yīng)中TNF-α作為重要的始發(fā)因子能作用于多種細(xì)胞，在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上激發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可以誘導(dǎo)IL-1β，IL-6，IL-8等細(xì)胞因子的瀑布樣釋放［17］，因此IL-1β、IL-6和TNF-α等除各自獨(dú)特的生物學(xué)作用外，還共同參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，并在其中互相補(bǔ)充、互相促進(jìn)、互相制約［18］，在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中形成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。本研究發(fā)現(xiàn)針刺后15min、8 h穴位局部IL-6、TNF-α濃度升高。針刺短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞因子濃度的升高可能是由于產(chǎn)生這些細(xì)胞因子的細(xì)胞在受針刺損傷刺激后，立即釋放出儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)的mRNA，并迅速產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子。8 h后IL-6、TNF-α濃度峰值可能與HMGB1、TLR4 8 h高表達(dá)相關(guān)，此外針刺后細(xì)胞因子的快速釋放在誘導(dǎo)和發(fā)動(dòng)炎癥反應(yīng)的同時(shí)，還會(huì)刺激穴區(qū)各種細(xì)胞，使之產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子和其他化學(xué)遞質(zhì)，形成各種因子協(xié)調(diào)工作網(wǎng)，共同完成針刺后炎癥的發(fā)生、發(fā)展和修復(fù)過(guò)程。

綜上所述，針刺后穴位局部產(chǎn)生的HMGB1可能作為穴位局部TLR4的內(nèi)源性配體，兩者結(jié)合后通過(guò)激活TLR4介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路，使穴位局部產(chǎn)生以TNF-α表達(dá)為主的炎癥反應(yīng)。穴位局部TLR4介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路可能是針刺后穴位局部炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的通路之一，但還有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：馬英，高杉）

Prelim inary research on the role of TLR4 at acupoints in the inflammatory reaction produced by acupuncture

XIQiang，CUIRui，JINGuang，GUOYong-ming
（ExperimentalResearch Center for Acupuncture in Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the role of TLR4 atacupoints in the inflammatory reaction produced by acupuncture.［Methods］The 80 health ratswere divided into acupuncture group and blank control group，each group 40 rats.Each group was random ly divided into8 time points（immediate，15min，30min，1 h，2 h，4 h，8 h，24 h），5 ratsper point.Testing the concentrationsofTLR4，HMGB1，IL-1β，IL-6，TNF-αin point area including skin and muscle tissue with ELISA.［Results］There were no significant changes in the concentration ofeach index ateach time point in controlgroup.Acupuncture could increase the concentrationsof TLR4，HMGB1，IL-6，TNF-α，whereas IL-1βconcentrations did not change.The concentrations of HMGB1，TNF-αhad certain relativity with the concentration of TLR4 respectively after acupuncture.However，the concentration of IL-6 had weaken relativity with TLR4and the concentration of IL-1βhad uncertain relativitywith TLR4.［Conclusion］TLR4 located atacupointsmay play an important part in the inflammatory reaction produced by acupuncture.

acupuncture；acupuncture point；TLR4；inflammatory reaction

R245.9

A

1672-1519（2015）02-0088-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.07

國(guó)家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（81102641）。

席強(qiáng)（1984-），男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)獒槾套饔檬紕?dòng)機(jī)制。

郭永明，E-mail:guoymxr@163.com。

（2014-10-14）