葉偉棟，李賽男，鮑若棟，茅其勝，應(yīng)濠澤，杜照奎＊，2，3

硝普鈉對銅脅迫下水稻幼苗生長的緩解效應(yīng)

葉偉棟1，李賽男1，鮑若棟1，茅其勝1，應(yīng)濠澤1，杜照奎＊1，2，3

（1.臺州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江臺州318000；2.浙江省植物進(jìn)化生態(tài)學(xué)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臺州318000；3.臺州學(xué)院生態(tài)研究所，浙江臺州318000）

為探討外源一氧化氮在緩解重金屬Cu2+脅迫中的作用，以水稻“蘇秀9號”為試料，通過水培試驗(yàn)研究了在重金屬Cu2+處理下硝普鈉對水稻幼苗生長和抗氧化能力的影響。試驗(yàn)表明30μmol·L-1的CuCl2處理顯著降低了水稻幼苗的株高、根長、根數(shù)和鮮重；并且提高了葉中H2O2和O2.-的含量，使幼苗遭受到嚴(yán)重的氧化脅迫，導(dǎo)致MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著提高；葉中SOD活性、POD活性、葉綠素含量和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著下降。外源添加50μmol·L-1硝普鈉后，30μmo l·L-1的CuCl2處理的幼苗株高、根長等較Cu2+處理顯著提高，葉中H2O2和O2.-的含量明顯下降，MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著降低；葉中SOD活性、POD活性、APX活性、CAT活性、葉綠素含量和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著升高。研究表明適量的SNP可以提高水稻抗氧化酶活性，降低ROS的含量，減緩葉片的膜脂過氧化程度，從而，更好地對抗重金屬Cu2+的毒害作用。

水稻；重金屬；一氧化氮；抗氧化酶

0　引言

近年來，由于電子垃圾拆解等人類活動所帶來的土壤重金屬污染已經(jīng)成為環(huán)境污染治理的難題［1，2］。據(jù)測算，我國重金屬污染的農(nóng)業(yè)土地約2.5×107hm2，占全國耕地總面積的20%［3］，土壤重金屬污染問題已引起了人們的廣泛關(guān)注。重金屬銅（Cu）是植物生長必須的微量元素，然而過量的Cu對植物產(chǎn)生毒害［4］，如：抑制光合作用和色素合成、產(chǎn)生氧化脅迫及其它代謝紊亂，影響植物的正常生長［5］。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是植物體內(nèi)的信號分子，它不僅調(diào)節(jié)著植物種子的萌發(fā)、生長、發(fā)育和衰老等過程，而且還參與植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)［6］。研究表明外源NO可緩解植物體如銅［7］、鎘［8］、鉻［9］、鉛［10］、鐵、鋅和錳［11］等重金屬的毒害，其機(jī)理是通過激活抗氧化酶系統(tǒng)和提高金屬硫蛋白（metallothionein）的含量間接消除活性氧（reactive oxygen species，ROS），降低了重金屬引起的氧化脅迫，從而提高植株對重金屬脅迫的抗性［12］。

水稻（Oryza sativa）不僅是重要的單子葉模式植物，而且還是世界上最重要的糧食作物之一。研究NO在降低水稻Cu毒害過程中的作用和生理機(jī)制，不僅有利于降低由于Cu污染造成的水稻減產(chǎn)，而且還有利于減少稻米中的Cu富集量，保證人們的身體健康，但有關(guān)施加外源NO緩解水稻Cu毒害的相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)主要分析外源NO供體硝普鈉（sodium nitrop russide，SNP）對Cu2+脅迫下水稻幼苗生長和生理特性的影響，以探明NO對提高小麥耐重金屬的作用，為闡明NO提高植物耐重金屬性的機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料的培養(yǎng)

水稻品種為蘇秀9號，由嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育，購自臨海市種子公司。種子用0.1%的HgCl2消毒后，流水沖洗干凈，再在清水中浸泡24h。將種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)箱中暗發(fā)芽2d，選擇出芽一致的幼苗置于珍珠巖上，Hoagland營養(yǎng)液澆灌培養(yǎng)，光照培養(yǎng)箱控制培養(yǎng)條件，光周期為12h，溫度為27℃，光強(qiáng)約為300μm ol·m-2·s-1，相對濕度為70%。

1.2Cu2+和SNP濃度的選擇

Cu2+濃度的選擇。將培養(yǎng)箱暗發(fā)芽2d的水稻幼苗用0、10、30、50和100μm ol·L-1CuCl2進(jìn)行處理，CuCl2以Hoagland營養(yǎng)液配制，每天更換一次處理液。7d后測量水稻的株高、根長、根數(shù)和鮮重，篩選出Cu2+脅迫的適合濃度。

SNP濃度的選擇。將培養(yǎng)箱暗發(fā)芽2d的水稻幼苗用含30μmol·L-1CuCl2的Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行處理，同時在溶液中加入0、50、100和150μm o l·L-1SNP，每天更換一次處理液。7d后測量水稻的株高、根長、根數(shù)和鮮重，篩選出SNP的適合濃度。

1.3生理指標(biāo)測定及方法

篩選出Cu2+濃度和SNP濃度后，將28℃培養(yǎng)箱中暗發(fā)芽3d的水稻幼苗進(jìn)行以下三種處理：（1）Hoagland營養(yǎng)液；（2）含Cu2+的Hoagland營養(yǎng)液；（3）含Cu2+的Hoagland營養(yǎng)液，且加入SNP。處理7 d后，測量以下指標(biāo)。

葉片電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法測定；丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法；過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法；過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的測定采用分光光度法；可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法。以上操作均參照高俊鳳方法［13］。

葉綠素相對含量（葉片SPAD值）的測定：選取第3片功能葉，采用SPAD502微型葉綠素儀進(jìn)行測定。

H2O2的染色：染色溶液為0.1g·L-1二胺基聯(lián)苯胺 （Diam inobezidine，DAB），用50mMTris-醋酸（pH5.0）溶解。將葉片浸泡在染色液中，25℃黑暗過夜，再將葉片置于乙醇:乳酸:甘油（3∶l∶1）固定液中煮沸l(wèi)0m in，冷卻，將葉片轉(zhuǎn)入新鮮的固定液中，室溫下過夜，拍照［14］。

O2.-檢測：染色液為0.1g·L-1的NBT，用25mmol·L-1磷酸緩沖液（pH7.6）溶解。將葉片浸泡染色液中，25℃黑暗保存16h后，置于乙醇:乳酸:甘油（3∶l∶1）固定液中煮沸10m in，冷卻，將葉片轉(zhuǎn)入新鮮的固定液中，室溫下過夜，拍照［14］。

1.4數(shù)據(jù)分析

每種處理均重復(fù)測定4次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-w ay ANOVA），并采用Duncan新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2　結(jié)果與分析

2.1Cu2+脅迫對水稻幼苗的生長的影響

水稻幼苗受Cu2+脅迫7d后，與對照相比，10μmol·L-1Cu2+處理并沒有顯著改變水稻的株高、根長、根數(shù)和鮮重（圖1）。但隨著Cu2+濃度的增加，水稻的株高、根長、根數(shù)和鮮重較對照均顯著下降（P＜0.05），30、50和100μm ol·L-1Cu2+處理的水稻株高較對照降分別低47.00%、69.53%和76.82%，根長較對照分別降低69.16%、83.77%和84.09%，根數(shù)較對照分別降低35%、80%和80%，鮮重較對照分別降低37.57%、51.97%和54.00%，表明Cu2+處理顯著抑制了水稻幼苗的生長。根據(jù)生長數(shù)據(jù)結(jié)果，我們選擇30μm ol·L-1Cu2+處理濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1　Cu2+脅迫對水稻幼苗生長的影響Fig.1 Effects of Cu2+stress on the grow th of rice seedlings

2.2外源NO對Cu2+脅迫下水稻幼苗生長的影響

將培養(yǎng)箱暗發(fā)芽2d的水稻幼苗用含30μm o l·L-1CuCl2的Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行處理，同時在溶液中分別加入0、50、100和150μmol·L-1SNP，培養(yǎng)7d后測量水稻生長指標(biāo)。結(jié)果表明：低濃度的SNP能顯著提高水稻幼苗的株高、根數(shù)和鮮重，但根長卻沒有顯著性變化，而高濃度的SNP則顯著抑制了這些指標(biāo)（圖2）。與30μmol·L-1Cu2+處理相比，添加50μm ol·L-1SNP處理的水稻株高、根數(shù)和鮮重分別增加86.80%、50.00%和29.62%，表明適當(dāng)濃度的SNP處理能顯著提高Cu2+脅迫下水稻幼苗的生長。根據(jù)生長數(shù)據(jù)結(jié)果，我們選擇50μmol·L-1SNP處理濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2　外源NO對Cu2+脅迫下水稻幼苗生長的影響Fig.2 Effects of nixie oxide on the grow th of rice seedlings under Cu2+stress

2.3外源NO對Cu2+脅迫下水稻幼苗H2O2和O2.-含量的影響

外界環(huán)境條件的脅迫（如：冷、熱、鹽、重金屬和臭氧等）誘發(fā)活性氧ROS（如H2O2、O2.-和1O2等）的產(chǎn)生，從而造成氧化脅迫已經(jīng)是一種普遍的現(xiàn)象［15］。與對照（Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)）相比，Cu2+處理的水稻幼苗葉中呈現(xiàn)較深的顏色，且面積更大，表明葉中產(chǎn)生了大量的H2O2（圖3A）和O2.-（圖3B），受到了較為強(qiáng)烈的活性氧脅迫；而添加SNP處理的水稻葉片中雖然也被染上顏色，但較Cu2+處理處的要淺，表明SNP的添加減輕了H2O2和O2.-對水稻的脅迫。

圖3　外源NO對Cu2+脅迫下水稻幼苗葉中H2O2（A）和O2.-（B）含量的影響Fig.3 E ffect of exogenous NO on H2O2（A）and O2-（B）in leaves of rice seed lings under Cu2+stress

2.4外源NO對Cu2+脅迫下水稻幼苗MDA含量和相對電導(dǎo)率的影響

MDA是植物組織在器官衰老或在逆境條件下膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，它會降低膜中不飽和脂肪酸的含量，使膜的流動性降低，損害膜系統(tǒng)；而膜受損后，胞內(nèi)離子外流也會導(dǎo)致電導(dǎo)率增加。因此，MDA含量和相對電導(dǎo)率的高低可以用來表示脂質(zhì)過氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)傷害程度［16］。水稻幼苗受到Cu2+脅迫后，葉片中MDA含量和相對電導(dǎo)率分別增加45.77%和22.98%，與對照差異顯著；而Cu2+處理且外施SNP后，與Cu2+處理相對，MDA含量和相對電導(dǎo)率均顯著下降，值與對照無顯著性差異（圖4）。表明外源NO可以降低水稻幼苗在重金屬銅脅迫下的氧化傷害。

圖4　外源NO對Cu2+脅迫下水稻幼苗葉MDA含量和相對電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effects of exogenous nitric oxide on the MDA contents and relative electrical conductivity in rice leaves under Cu2+stress

2.5外源NO對Cu2+脅迫下水稻幼苗葉片保護(hù)酶活性的影響

低水平的ROS不會對植物造成傷害，但是逆境脅迫導(dǎo)致ROS的迸發(fā)通常會對植物造成強(qiáng)烈的氧化脅迫。經(jīng)過長期的適應(yīng)與進(jìn)化，植物體內(nèi)形成了ROS清除系統(tǒng)，以應(yīng)對逆境脅迫帶來的傷害。SOD是清除體內(nèi)的O2.-的主要酶類它可以將植物體內(nèi)的O2.-歧化成H2O2和O2，從而減輕O2.-對植物造成的氧化脅迫；POD、CAT和APX（主要位于葉綠體中）均可將H2O2降解產(chǎn)物為H2O2和O2，避免H2O2的蓄積對細(xì)胞膜產(chǎn)生傷害［17］。與對照比，Cu2+顯著處理降低了水稻葉SOD（圖5A）和POD（圖5B）的活性，降幅分別達(dá)51.66%和41.09%，而Cu2+處理且外施SNP后，兩者活性與對照比均無顯著差異。與對照相比，Cu2+處理并沒有顯著改變水稻葉APX（圖5C）和CAT（圖5D）活性，但外施SNP則顯著提高了APX和CAT的活性，這與H2O2組織染色結(jié)果相吻合。

圖5　外源NO對Cu2+脅迫下水稻幼苗葉中SOD（A）、POD（B）、APX（C）和CAT（D）活性的影響Fig.5 Effect of exogenous NO on activities o f SOD（A），POD（B），APX（C）and CAT（D）in leaves of rice seed lings under Cu2+stress

2.6外源NO對Cu2+脅迫下水稻幼苗葉綠素和葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

葉綠素是綠色植物光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，葉綠素含量的高低反映葉片生理活性變化的重要指標(biāo)［18］。與對照相比，Cu2+處理的水稻幼苗相對葉綠素含量降低了39.32%，差異顯著，這與肉眼觀察Cu2+處理葉片顏色泛黃相一致；Cu2+處理且外施SNP后，與Cu2+處理相對，相對葉綠素含量顯著升高，值與對照無顯著性差異（圖6A）。植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多是參與各種代謝的酶類，受到逆境脅迫，它們會發(fā)生一定的變化，測定其含量是了解植物抗逆性的一個重要指標(biāo)［19］。Cu2+脅迫下水稻幼苗葉片中蛋白質(zhì)含量顯著下降，僅為對照的86.57%，二者差異顯著，外源添加SNP后，可溶性蛋白質(zhì)含量均高于Cu2+脅迫處理，差異達(dá)顯著水平，表明外源SNP提高了水稻幼苗適應(yīng)脅迫的能力。

圖6　外源NO對Cu2+脅迫下水稻幼苗葉中葉綠素（A）和可溶性蛋白質(zhì)（B）含量的影響Fig.6 Effec t of exogenous NO on con tent of soluble proteins in leaves of rice seed lings under Cu2+stress

3　結(jié)論

30μmol·L-1的CuCl2提高了水稻葉中H2O2和O2.-的含量，使幼苗遭受到嚴(yán)重的氧化脅迫，并且并導(dǎo)致MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著提高，葉綠素含量和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著下降，因而顯著降低了水稻幼苗的株高、根長、根數(shù)和鮮重；外源添加50μmol·L-1SNP后，水稻葉中H2O2和O2.-的含量明顯下降，MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著降低，葉中SOD、POD、APX和CAT活性，以及葉綠素含量和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著升高，CuCl2處理的幼苗株高、根長等較Cu2+處理顯著提高。結(jié)果表明，外源施加硝普鈉通過提高葉片抗氧化酶活性，降低氧化脅迫緩解水稻幼苗Cu的毒害。

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（責(zé)任編輯：耿繼祥）

Effects of Sodium Nitroprusside On A lleviating the Toxicity of Copper in Rice Seed lings

YE Weidong1，LI Sainan1，BAO Ruodong1，MAO Qisheng1，YING Haoze1，DU Zhaokui*1，2，3
（1.School of Life Sciences，Taizhou University，Taizhou 318000，China；2．Zhejiang Provincial Key Laborato ry of Plant Evolutionary Ecology and Conservation，Taizhou 318000，China；3．Institu te of Ecology，Taizhou University，Taizhou 318000，China）

In order to investigate the effects o f sodium nitroprusside（SNP） in relieving heavy metal stress，the grow th and antioxidative indexes of seedlings under copper stress were studied by w ater culture experiment w ith rice"Suxiu 9"as the specimen.The results shows that 30μmol·L-1CuCl2treatment significantly reduced the height，root length，root number and fresh w eight of rice seedlings，and enhanced the content o f H2O2and O2.-in leaves，so the seed lings suffered severe oxidative stress，resulting in a significant increase o f MDA and relative conductivity.Moreover，SOD activity，POD activity，chlorophyll and so luble protein content in leaves decreased significantly as w ell.However，when exogenously 50μmol·L-1SNP w ere added to 30μmol·L-1CuCl2，the plant height，the root length of rice，compared w ith Cu2+treatment，obviously increased，w hile H2O2and O2.-content in leaves decreased significantly，MDA conten t and relative conductivity significantly reduced，and SOD activity，POD activity，APX activity，CAT activity，chlorophy ll and soluble protein content in leaves w ere significantly increased.The results shows that:p roper SNP concentration can increase antioxidant enzyme activity in rice leaves，reduce the amount of ROS，and alleviate leaf membrane lipid peroxidation，hence，resisting the toxic effects of heavy metal Cu2+better.

Rice；Heavy metal；Nitric oxide；Antioxidative enzymes

10.13853/j.cnk i.issn.1672-3708.2015.03.006

2014-11-09；

2014-12-22

簡介：杜照奎（1979-），男，湖北隨州人，講師，博士，主要從事植物分子生態(tài)學(xué)研究。