徐海軍，葉志鵬，徐姚力，張金燕，李 麗

（海寧市公安司法鑒定中心，浙江 海寧 314400）

植絨和棉簽拭子對(duì)不同載體微量生物物證的提取研究

徐海軍，葉志鵬，徐姚力，張金燕，李 麗

（海寧市公安司法鑒定中心，浙江 海寧 314400）

目的 比較4N6FLOQSwabsTM植絨拭子和復(fù)合納米棉簽拭子對(duì)微量生物樣本DNA的提取效果。方法 選取常見的三種載體（玻璃、一字開刀、抽屜拉手），經(jīng)消毒去污處理，模擬載體表面微量DNA樣本，分別采用4N6FLOQSwabsTM植絨拭子和復(fù)合納米棉簽拭子提取載體上微量DNA樣本，以檢出STR分型基因座數(shù)量、等位基因丟失數(shù)量、峰高面積三個(gè)方面作為提取效果的比較指標(biāo)。結(jié)果 4N6FLOQSwabsTM植絨拭子提取微量DNA樣本組成功檢出5份微量DNA樣本，有效檢出4份；復(fù)合納米棉簽拭子提取微量DNA樣本組中9份微量DNA樣本均有效檢出；復(fù)合納米棉簽拭子提取組的等位基因丟失數(shù)量顯著多于4N6FLOQSwabsTM，峰高面積顯著低于4N6FLOQSwabsTM。 結(jié)論 4N6FLOQSwabsTM植絨拭子對(duì)本研究中的玻璃表面指紋印、開刀表面脫落細(xì)胞和抽屜拉手表面脫落細(xì)胞的DNA提取效果顯著優(yōu)于復(fù)合納米棉簽拭子。

法醫(yī)遺傳學(xué)；微量DNA；DNA提取；4N6FLOQSwabsTM植絨拭子；復(fù)合納米棉簽拭子

長(zhǎng)期以來，微量DNA樣本的檢驗(yàn)一直是個(gè)難題。有學(xué)者通過更高濃度DNA模板［1］或增加擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)［2］、純化擴(kuò)增產(chǎn)物等方式來提高微量DNA檢出率［3，4］。要提高微量DNA的檢出率，不能僅局限于DNA提取、擴(kuò)增、檢測(cè)方法的改良，更應(yīng)注重對(duì)不同載體表面DNA的提取，提高載體表面DNA提取效果。本研究模擬了三種犯罪現(xiàn)場(chǎng)常見的載體表面微量DNA樣本，分別采用4N6FLOQSwabsTM植絨拭子和復(fù)合納米棉簽拭子進(jìn)行DNA提取，并對(duì)獲得的常染色體多態(tài)性STR分型結(jié)果進(jìn)行比較分析，旨在為選擇微量DNA檢材的提取手段提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

QIAcube純化儀（美國(guó)QIAGEN公司），24孔2.0 mL恒溫混勻儀（德國(guó)Eppendorf公司），高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），QIAamp DNA Investigator Kit（美國(guó)QIAGEN公司），Identifiler PlusTMkit（美國(guó)Life Technologies公司），9700型擴(kuò)增儀（美國(guó)Life Technologies公司），3130XL分析儀（美國(guó)Life Technologies公司）。

4 N6FLOQSwabsTM植絨拭子（美國(guó)Life Technologies公司）；復(fù)合納米棉簽拭子（北京佰優(yōu)意諾言科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣本

樣本準(zhǔn)備：已知DNA分型的試驗(yàn)人員三名，分別編號(hào)為A，B，C；規(guī)格為5cm×5cm的玻璃6塊和同一型號(hào)的一字開刀6把，辦公室相同類型抽屜拉手6處，試驗(yàn)前對(duì)以上樣本和載體表面采用相同方法處理：先用10%漂洗液（7 mmol/L次氯酸鈉溶液）反復(fù)擦拭玻璃表面，再用75%的乙醇反復(fù)擦洗，晾干待用。

樣品采集：三名試驗(yàn)人員分別用左右手大拇指在兩塊規(guī)格為5cm×5cm的玻璃上捺指紋印1枚，用左右手各握1把一字開刀10 s，用左右手拉辦公室抽屜拉手處進(jìn)行開關(guān)動(dòng)作2次。

樣本提取與編號(hào)：分別采用4N6FLOQSwabsTM植絨拭子和復(fù)合納米棉簽拭子，干濕兩步擦拭法對(duì)三名試驗(yàn)人員的平行樣本進(jìn)行提取，6枚指紋印分別編號(hào)為A1，A2，B1，B2，C1，C2；6把一字開刀表面擦拭分別A3，A4，B3，B4，C3，C4；6處辦公室抽屜拉手表現(xiàn)擦拭分別編號(hào)為A5，A6，B5，B6，C5，C6。 其 中 A1，A3，A5，B1，B3，B5，C1，C3，C5為4N6FLOQSwabsTM植 絨 拭 子 提 取 樣 本，A2，A4，A6，B2，B4，B6，C2，C4，C6為復(fù)合納米棉簽拭子提取樣本。

1.3 檢驗(yàn)方法

DNA提?。焊鳂颖痉謩e置于2.0 mL帶過濾籃的離心管中，加入480 μL ATL和20 μL PK，置于56℃恒溫混勻儀900 r/min裂解2 h，裂解好后13000 r/ min離心5 min，棄過濾籃，在濾下的液體中加入1 μL載體RNA，混勻后置于QIAcube純化儀中，啟動(dòng)程序進(jìn)行樣本DNA的提取。

STR復(fù)合擴(kuò)增及檢測(cè)分析：用Identifiler? PlusTM試劑盒、9700型擴(kuò)增儀擴(kuò)增，各組樣本分別設(shè)3個(gè)平行進(jìn)行相同條件擴(kuò)增。采用10 μL擴(kuò)增體系，模板DNA 4 μL，Reaction Mix 4 μL，Primer Set 2 μL。用3130XL分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，使用GeneMapper ID V3.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

參考共有圖譜分析法［5］，采用重復(fù)出現(xiàn)的等位基因來判定STR分型檢驗(yàn)結(jié)果（3個(gè)平行樣本的同一基因座出現(xiàn)兩次或以上相同數(shù)值分型，即認(rèn)定該基因座檢出該數(shù)值分型［6］），從認(rèn)定的STR分型結(jié)果中統(tǒng)計(jì)各樣本DNA圖譜的檢出基因座數(shù)量、等位基因丟失數(shù)量以及檢出等位基因峰高面積。完整的16個(gè)基因座包括15個(gè)常染色體STR基因座及Amelogenin基因座，檢出16個(gè)基因座分型為“成功”，檢出9個(gè)以上STR基因座及Amelogenin基因座為“有效”。

植絨拭子和棉簽拭子對(duì)玻璃表面指紋印、一字開刀表面脫落細(xì)胞、抽屜拉手表面脫落細(xì)胞的DNA常染色體多態(tài)性STR分型檢驗(yàn)結(jié)果比較分別見表1、表2、表3。18份微量DNA檢材，成功檢出5份，有效檢出13份，未檢出混合基因分型，陰陽型對(duì)照均正常。選用4N6FLOQSwabsTM植絨拭子和復(fù)合納米棉簽分別提取的9份微量DNA樣本中，利用植絨拭子提取的微量DNA樣本中有5份成功檢出16個(gè)基因座分型，4份有效檢出9個(gè)以上基因座分型；復(fù)合納米棉簽拭子提取的9份微量樣本均為有效檢出。未成功檢出的13份微量樣本均不同程度地出現(xiàn)等位基因丟失的情況，4N6FLOQSwabsTM植絨拭子提取的微量樣本丟失的等位基因座主要是CSF1PO、D18S51及D2S1338等長(zhǎng)片段基因座，以丟失單個(gè)基因?yàn)橹?，?fù)合納米棉簽拭子提取的微量樣本組等位基因丟失的基因座除CSF1PO、D18S51、D2S1338、TPOX、D16S539等 長(zhǎng) 片 段 外， 在vWA、D5S818等基因座也有丟失情況出現(xiàn)，丟失數(shù)量顯著多于4N6FLOQSwabsTM植絨拭子提取組，部分長(zhǎng)片段還出現(xiàn)了完全丟失情況；復(fù)合納米棉簽拭子提取的微量DNA樣本檢出的等位基因峰高明顯低于4N6FLOQSwabsTM植絨拭子提取的微量樣本。從檢出基因座數(shù)量、等位基因丟失數(shù)量、峰高面積拉手表面脫落細(xì)胞的STR分型結(jié)果，4N6FLOQSwabsTM植絨拭子對(duì)上述三種載體的DNA提取效果顯著好于復(fù)合納米棉簽拭子。

表1 指紋的STR分型結(jié)果比較Table1 Comparison of STR profi les of fi ngerprint DNA extracted with two kinds of swabs

表2 一字開刀表面DNA的STR分型結(jié)果比較Table2 Comparison of STR profi les of DNA extracted with two kinds of swabs from screwdrivers

表3 抽屜拉手表面DNA的常染色體多態(tài)性STR分型檢驗(yàn)結(jié)果比較Table3 Comparison of STR profi les of DNA extracted with two kinds of swabs from drawer handles

目前對(duì)接觸類生物檢材提取方法主要有棉簽拭子干濕兩步擦拭法、脫落細(xì)胞粘取法等，本研究中引入4N6FLOQSwabsTM植絨拭子，與傳統(tǒng)的復(fù)合納米棉簽拭子對(duì)三種載體DNA提取效果比較分析，結(jié)果顯示，4N6FLOQSwabsTM植絨拭子提取效果顯著好于傳統(tǒng)的復(fù)合納米棉簽拭子，其主要原因有：（1）4N6FLOQSwabsTM植絨拭子利用尼龍纖維植絨填充技術(shù)最大限度地提高DNA采集和洗脫效率。與傳統(tǒng)的普通棉簽不同，植絨拭子的尼龍纖維結(jié)構(gòu)垂直于基底，使整個(gè)樣本采集區(qū)域無內(nèi)部吸收孔，DNA不易分散和滯留，洗脫更快更高效；（2）4N6FLOQSwabsTM植絨拭子擦拭微量樣本表面后，包裝在密封的光管中，拭子頭部懸空，不接觸其它物體表面，不存在二次轉(zhuǎn)移，棉簽拭子提取微量樣本后采用濾紙包裹，使棉簽上的脫落細(xì)胞等微量樣本轉(zhuǎn)移到濾紙上，增大了微量樣本DNA含量的損耗［7］；（3）4N6FLOQSwabsTM植絨拭子對(duì)樣本的吸附和釋放能力更強(qiáng)，由于植絨拭子材料與結(jié)構(gòu)的特殊性，在采集樣本時(shí)可更大程度吸附人體脫落細(xì)胞，在對(duì)樣本進(jìn)行裂解消化時(shí)，樣本中微量成分也可高效釋放，不滯留微量成分在植絨拭子內(nèi)部。而傳統(tǒng)的復(fù)合納米棉簽拭子由吸水性更強(qiáng)的纖維制成，在裂解消化過程中，樣本中微量成分容易滯留在纏繞的纖維團(tuán)中，影響DNA提取效果。需要注意的是，植絨拭子的吸水能力低于棉簽拭子，在對(duì)灰塵較多、覆蓋雜質(zhì)較多的物體表面的DNA提取時(shí)可能會(huì)受到一定的影響，這有待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

［1］ 張曉紅，吳微微.3種常見體表痕跡接觸性DNA的檢驗(yàn)［J］.刑事技術(shù)，2012（6）:52-54.

［2］ 吳微微，郝宏蕾，金胄，等.PCR擴(kuò)增3因素對(duì)低拷貝模板STR分型的影響研究［J］.中國(guó)法醫(yī)雜志，2006， 21（6）:4-6.

［3］ 侯一平.法醫(yī)學(xué)進(jìn)展與實(shí)踐（第7卷） ［M］.成都:四川大學(xué)出版社，2010:1-6.

［4］ Hanson EK，Ballantyne J.Whole genome amplification strategy for forensic genetic analysis using single or few cell equivalents of genomic DNA ［J］.Anal Biochem， 2005，346（2）:246-257.

［5］ 張廣峰，陳松，涂政，等.接觸DNA檢驗(yàn)成功率的影響因素探討［J］.刑事技術(shù)，2013（3）:9-14.

［6］ Bright JA， Gill P， Buckleton J.Composite profiles in DNA analysis ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2012，6（3）:317-321.

［7］ Mariya G， van Oorschota RAH， Mitchellb JR.DNA transfer within forensic exhibit packaging: Potential for DNA loss and relocation［J］.Forensic Sci Int Genet， 2012，6（2）:158-166.

本文引用格式：徐海軍， 葉志鵬， 徐姚力， 等.植絨和棉簽拭子對(duì)不同載體微量生物物證的提取研究 ［J］.刑事技術(shù)，2015，40（5）:373-375.

Trace DNA Extraction from Three Kinds of Carrier Using 4N6FLOQSwabsTMand Nano-cotton Swab

XU Haijun， YE Zhipeng， XU Yaoli， ZHANG Jinyan， LI Li
（Institute of Forensic Science， Haining Public Security Bureau，Zhejiang Haining 314400， China）

Objective To compare the effect of the 4N6FLOQSwabsTMand Nano-cotton swab on extracting trace DNA.Methods Three kinds of pre-decontaminated carriers， glass， screw driver and drawer’s handle， were used to contact volunteers’hands and 9 pairs of samples of human trace DNA （fingerprints on glass， exfoliated cells on screwdrivers and drawer handles） were prepared.DNA was extracted by either 4N6FLOQSwabsTMand/or Nano-cotton swab from all the samples and analyzed with GeneMapper ID V3.2 software.The DNA extract effi ciency was judged by the quantity of the detected loci，the loss of allelic genes and the peak area.Results For the 4N6FLOQSwabsTM， fi ve samples were successfully detected and the other four were effectively detected.For the Nano-cotton swab， all the nine samples were detected just at the effective level along with more signifi cant loss of allelic gene and more remarkable lower peak area than the corresponding one of the 4N6FLOQSwabsTM.Conclusions The effect of extracting trace DNA using 4N6FLOQSwabsTMis better than that using Nanocotton swab.

forensic genetics； trace DNA； DNA extraction；4N6FLOQSwabsTM； Nano-cotton swab

DF795.2

A

1008-3650（2015）05-0373-03

10.16467/j.1008-3650.2015.05.006

徐海軍（1984—），男，浙江海寧人，法醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)遺傳學(xué)。 E-mail: xinhaijin1232000@163.com

2014-10-01