張 囡，王 炯，張雅婷，宋 剛，詹珊珊，潘勇兵（武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司抗體研究室，湖北武漢 430207）

全人源抗人腫瘤壞死因子α 單克隆抗體注射液對食蟹猴的長期毒性試驗

張 囡，王 炯，張雅婷，宋 剛，詹珊珊，潘勇兵
（武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司抗體研究室，湖北武漢 430207）

目的 評價全人源抗人腫瘤壞死因子α單克隆抗體（抗-hTNF-α FHMA）注射液對食蟹猴的長期毒性。方法將40只食蟹猴隨機分成5組，分別為陰性對照組、阿達(dá)木單抗10 mg·kg-1對照組和抗-hTNF-α FHMA 2，10和50 mg·kg-1組，經(jīng)皮下注射每周給藥1次，連續(xù)給藥5次，停藥后恢復(fù)期4周。實驗期間進行臨床觀察、體質(zhì)量、體溫、心電圖、血細(xì)胞計數(shù)、凝血功能、血液生化、尿液、眼科、免疫指標(biāo)、臟器及組織病理觀察，同時進行血藥濃度檢測，分析毒代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 實驗期間各組食蟹猴的觀察、體質(zhì)量、體溫、心電圖參數(shù)、眼科檢查、血細(xì)胞計數(shù)、凝血功能、血生化、尿液分析、淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子、血清免疫球蛋白和血清補體等指標(biāo)均未見與給藥相關(guān)的具有毒理意義的改變；抗-hTNF-α FHMA和阿達(dá)木單抗均可引起食蟹猴體內(nèi)產(chǎn)生抗藥抗體，且具有中和活性。抗-hTNF-α FHMA在體內(nèi)基本呈線性動力學(xué)特征。相同劑量下與阿達(dá)木單抗呈現(xiàn)相似的免疫原性和代謝動力學(xué)特征。結(jié)論 抗-hTNF-α FHMA未觀察到不良反應(yīng)的劑量為50 mg·kg-1，相當(dāng)于臨床擬用劑量（0.67 mg·kg-1）的75倍，表明抗-hTNF-α FHMA臨床應(yīng)用安全性較好。

單克隆抗體；腫瘤壞死因子α；阿達(dá)木單抗；成束猴；毒性試驗

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.011

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為特征的全身性自身免疫病，具有明顯的致殘性。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是炎癥通路中重要的細(xì)胞因子，在RA患者關(guān)節(jié)腔滑膜液中，TNF-α的濃度明顯增高，促進炎癥反應(yīng)、滑膜細(xì)胞異常增殖和凋亡、血管翳生成及軟骨與骨的破壞，促進RA炎癥反應(yīng)持續(xù)性進展［1－2］。因此，TNF-α成為治療RA的一個有效靶點。在RA的臨床治療中，TNF抑制劑如阿達(dá)木單抗（adalimumab，Humira?）、依那西普（etanercept）和英昔單抗（infliximab）均表現(xiàn)出了良好的療效，能顯著減輕臨床癥狀及體征，改善關(guān)節(jié)功能［3-7］。

本室進行了阿達(dá)木單抗的生物類似藥開發(fā)，所研制的全人源抗人TNF-α單克隆抗體（fully humanized anti-hTNF-α monoclonal antibody，hTNF-α FHMA）采用重組CHO哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)、經(jīng)化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中進行流加培養(yǎng)（Fed-batch）、純化及病毒滅活等工藝進行制備，擬皮下注射用于RA等自身免疫性疾病的治療。抗-hTNF-α FHMA以2，10和50 mg·kg-1每周1次皮下注射，連續(xù)給予食蟹猴4周后，觀察可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、末次給藥后4周毒性反應(yīng)的恢復(fù)情況及可能出現(xiàn)的延遲毒性反應(yīng)［8-10］，同時與原研藥阿達(dá)木單抗注射液進行比較，為抗-hTNF-α FHMA的臨床研究提供動物實驗資料。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

普通級食蟹猴40只，雌雄各半，購自廣西雄森靈長類實驗動物養(yǎng)殖開發(fā)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2011-0002，實驗動物質(zhì)量合格證編號：0002815和0002816。ADVIA 2120全自動血球分析儀購自德國Bayer公司；CA-500全自動血凝分析儀購自日本SYSMEX公司；TBA-120FR全自動生化分析儀購自日本東芝公司；EasyLyte電解質(zhì)分析儀購自美國Medica公司；Clinitek AdvantusTM尿液分析儀購自德國西門子公司；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀和Cytometric Bead Array（CBA）試劑盒購自美國BD公司；ELISA IgG試劑盒、ELISA IgM試劑盒和ELISA IgA試劑盒均購自美國ADI公司；ELISA C3試劑盒和C4試劑盒均購自上海瓦蘭生物科技有限公司。

1.2 藥品和對照品

抗-hTNF-α FHMA注射液由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號20130402；原研藥對照品阿達(dá)木單抗注射液由雅培公司生產(chǎn)，批號17293LX02；陰性對照品0.9%氯化鈉注射液購自江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司，批號12120302。

1.3 動物分組和給藥

從儲備動物中選取40只體質(zhì)量相近的健康食蟹猴，隨機分成5組，每組8只，雌雄各半。陰性對照組給予0.9%氯化鈉注射液，原研藥對照組給予阿達(dá)木單抗注射液10 mg·kg-1，實驗組分別給予抗-hTNF-α FHMA 2，10和50 mg·kg-1，各組每周sc給藥1次，連續(xù)給藥4周，共給藥5次。每組中雌雄食蟹猴的前2只于末次給藥后次日解剖，后2只于4周恢復(fù)期結(jié)束后解剖。

1.4 臨床觀察

觀察食蟹猴的精神狀態(tài)、行為活動、進食情況、糞便性狀、皮毛、眼、耳、口、鼻、腹部、外生殖器、肛門、四肢、足和呼吸等。給藥前及給藥后次日觀察注射局部是否出現(xiàn)紅斑、腫脹、潰瘍和硬結(jié)等改變。

1.5 體質(zhì)量和體溫檢測

給藥前、給藥后每周1次及安樂死前稱量食蟹猴體質(zhì)量；測量體溫時間為首次給藥前、藥后2～4 h（第1天）、藥后次日（第2天）、第3次藥后2～4 h（第15天）、末次藥后2～4 h（第29天）、末次藥后次日（第30天）和恢復(fù)期結(jié)束。

1.6 心電圖檢測

測定肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，觀察心率、P-R間期、Q-T間期和QRS時限，檢測時間同體溫測定。

1.7 眼科檢查

實驗前、末次給藥前3 d（第26天）和恢復(fù)期結(jié)束前3 d（第54天）進行眼科檢查，包括眼瞼、鞏膜、角膜、結(jié)膜、虹膜、瞳孔、晶狀體、玻璃體和眼底。

1.8 血液學(xué)指標(biāo)檢測

于首次給藥前、首次藥后次日（第2天）、第3次藥后次日（第16天）、末次藥后次日（第30天）和恢復(fù)期結(jié)束（第57天）采集全血進行血細(xì)胞計數(shù)；首次給藥前、第3次藥后次日（第16天）、末次藥后次日（第30天）和恢復(fù)期結(jié)束（第57天）檢測凝血功能。

1.9 血液生化指標(biāo)

于首次給藥前、第3次藥后次日（第16天）、末次藥后次日（第30天）和恢復(fù)期結(jié)束（第57天）檢測肝功能、腎功能、血糖、血脂及血電解質(zhì)等指標(biāo)。

1.10 尿液分析

于實驗前、末次給藥前3天（第26天）、恢復(fù)期結(jié)束前3天（第54天）進行尿常規(guī)檢測。

1.11 免疫指標(biāo)檢測

1.1 1.1淋巴細(xì)胞亞群

血細(xì)胞計數(shù)的同時取血樣，流式細(xì)胞儀檢測CD3+淋巴細(xì)胞百分率，計算CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞占CD3+淋巴細(xì)胞中的百分率，計算CD4+/CD8+比值，檢測CD2+，CD14+，CD16+，CD20+，CD21+和CD45RA+淋巴細(xì)胞的百分率。

1.1 1.2抗藥抗體檢測

每次給藥前、末次藥后2周（第43天）和恢復(fù)期結(jié)束（第57天）采集全血分離血清，采用橋聯(lián)ELISA法檢測特異性IgG抗體。將抗-hTNF-α FHMA/阿達(dá)木單抗稀釋至5 g·L-1后包被96孔酶標(biāo)板，待檢血清系列稀釋作為一抗，抗人TNF-α單抗用辣根過氧化物酶標(biāo)記后作為二抗，顯色后在波長450 nm處測吸光度（A450 nm）值。以ELISA檢測自身給藥前1∶100稀釋血清得的A450 nm值乘以1.5作為cut-off值（陽性/陰性判定值），如給藥組動物血清的A450 nm值≥cut-off值，判定為抗體陽性，否則為陰性。

1.1 1.3抗藥抗體中和活性檢測

部分食蟹猴產(chǎn)生抗藥抗體，取抗體滴度較高的5只食蟹猴，將其首次給藥前（第1天）及末次給藥前（第28天）血清進行抗體中和活性檢測。取生長狀態(tài)良好的L929細(xì)胞，0.25%胰酶消后，以1.5× 108L-1細(xì)胞密度平鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h；將待測血清用1 mg·L-1阿達(dá)木單抗溶液進行系列稀釋，稀釋后的溶液與4 μg·L-1rhTNF-α溶液等體積混合，加入L929細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后甲紫染色，酶標(biāo)儀測定A570 nm值，抗藥抗體中和活性與A570 nm值呈負(fù)相關(guān)。

1.1 1.4細(xì)胞因子檢測

首次給藥前、末次藥后次日（第30天）和恢復(fù)期結(jié)束（第57天）采集靜脈血，分離血清。采用CBA試劑盒進行血清中白細(xì)胞介素（interleukin-2，IL-2），IL-4，IL-5，IL-6，TNF-α和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）含量的檢測分析。

1.1 1.5血清免疫球蛋白檢測

首次給藥前、末次藥后次日（第30天）和恢復(fù)期結(jié)束（第57天）采集靜脈血，分離血清。采用市售ELISA IgG，IgM和IgA試劑盒檢測血清IgG，IgM和IgA含量。

1.1 1.6血清補體檢測

首次藥前、末次藥后次日（第30天）和恢復(fù)期結(jié)束（第57天）采集靜脈血，分離血清。采用市售ELISA C3和C4試劑盒檢測血清中C3和C4補體含量。

1.12 系統(tǒng)解剖和組織病理觀察

每組每性別的前2只食蟹猴于末次藥后次日（第30天）實施安樂死，每組每性別其余2只食蟹猴經(jīng)4周恢復(fù)期觀察后在第57天實施安樂死。所有安樂死食蟹猴進行大體解剖觀察，主要臟器稱重，計算臟器系數(shù)，并對40余種組織器官進行組織病理檢查。

1.13 毒代動力學(xué)分析

陰性對照組食蟹猴于首次和第4次給藥前及藥后4 h采血。其余4組食蟹猴分別于首次給藥前、藥后4，24，48，72，96，120，144和168 h采血；第3次給藥前、藥后96 h（第19天）采血；第4次給藥前、藥后4，24，48，72，96，120，144和168 h采血及末次給藥后2周（第43天）和恢復(fù)期結(jié)束（第57天）采血?？鼓蛛x血漿，ELISA法檢測血藥濃度。rhTNF-α稀釋至0.5 mg·L-1包被96孔酶標(biāo)板，稀釋的血漿樣品作為一抗，加入工作濃度辣根過氧化物酶-羊抗人IgG作為二抗，底物顯色后酶標(biāo)儀測定A450/620 nm值，使用代謝動力學(xué)數(shù)據(jù)分析軟件WinNonlin （V6.2）采用非房室模型法（NCA）對血藥濃度數(shù)據(jù)進行分析，計算AUC，cmax和Tmax等參數(shù)。

1.14 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察結(jié)果

實驗期間，各組食蟹猴精神狀態(tài)良好，活動正常，未出現(xiàn)死亡或瀕死現(xiàn)象。給藥期間，陰性對照組和抗-hTNF-α FHMA 2，10和50 mg·kg-1組各有2/8，3/8，1/8和4/8食蟹猴給藥局部可見紅斑，認(rèn)為可能是機械性刺激所致，與藥物不相關(guān)。與同期陰性對照組相比，各組食蟹猴體質(zhì)量均無統(tǒng)計學(xué)意義的差異。阿達(dá)木單抗對照組、抗-hTNF-α FHMA 2 和10 mg·kg-1組食蟹猴第2天體溫分別為38.75± 0.27，38.85±0.31和（38.98±0.62）℃，與同期陰性對照組（38.03±0.38）℃相比輕微升高（P＜0.05），抗-hTNF-α FHMA 50 mg·kg-1組食蟹猴第15天體溫（39.30±0.32）℃與同期陰性對照組（38.63± 0.60）℃相比輕微升高（P＜0.05），但這些改變輕微或在正常值范圍內(nèi)，不具有毒理學(xué)意義。與同期陰性對照組比較，各組食蟹猴心電圖參數(shù)均未見統(tǒng)計學(xué)意義的差異，心電圖波形未見與給藥相關(guān)的明顯異常改變。實驗期間，各組食蟹猴的眼瞼、鞏膜、角膜、結(jié)膜、虹膜、瞳孔、晶狀體、玻璃體和眼底均未見異常。

2.2 血液學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果

各組食蟹猴血細(xì)胞計數(shù)未見有毒理學(xué)意義的改變。盡管與陰性對照相比，抗-hTNF-α FHMA存在一些輕微但有統(tǒng)計學(xué)意義的改變：第30天2 mg·kg-1組單核細(xì)胞（0.51±0.15）×109L-1升高，10 mg·kg-1組紅細(xì)胞容積（39.61±2.47）%降低；第57天2 mg·kg-1組平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）（292.5± 3.9）g·L-1降低、中性粒細(xì)胞升高（41.48±3.74）%，50 mg·kg-1組MCHC（296.8±7.3）g·L-1降低。但這些改變?nèi)栽谡Ｖ捣秶鷥?nèi)，且未見明確的與給藥劑量或給藥時間的相關(guān)性，故認(rèn)為不具有毒理學(xué)意義。與同期陰性對照組相比，各組食蟹猴凝血功能指標(biāo)均未見統(tǒng)計學(xué)意義的差異。

2.3 血液生化指標(biāo)

與同期陰性對照組相比，第30天和第57天阿達(dá)木單抗對照組谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高；第16天抗-hTNF-α FHMA 2 mg·kg-1組白蛋白/球蛋白比值降低，10 mg·kg-1組甘油三酯降低，第57天10和50 mg·kg-1組谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高（P＜0.05）。甘油三酯降低幅度小且未見明確的與給藥劑量或給藥時間的相關(guān)性；不同時間點各給藥組雖有谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高或白蛋白/球蛋白比值的降低，但未見明顯的規(guī)律性改變；與肝相關(guān)的其他指標(biāo)如谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶、總蛋白、總膽紅素及肝組織病理學(xué)檢查均未見明顯異常改變，因此認(rèn)為以上改變不具有毒理學(xué)意義。上述異常結(jié)果歸納見表1，其余指標(biāo)與同期陰性對照相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4 尿液分析

與同期陰性對照組和同組藥前值相比，各給藥組食蟹猴在末次藥前和恢復(fù)期結(jié)束時的尿液指標(biāo)檢查未見明顯異常的規(guī)律性變化。

2.5 免疫學(xué)指標(biāo)

2.5.1 淋巴細(xì)胞亞群

與陰性對照組相比，抗-hTNF-α FHMA10和50 mg·kg-1組CD14+百分率于第16天降低〔（1.29±0.98）%和（1.13±1.12）%vs（2.35±0.80）%〕（P＜0.05），但未見明確的與給藥劑量或給藥時間的相關(guān)性，且與CD14+生物學(xué)意義相關(guān)的CD16+未見明顯異常改變，故認(rèn)為不具有毒理學(xué)意義。

Tab.1 Effect of fully humanized anti-hTNF-α monoclonal antibody（anti-hTNF-α FHMA）on cynomolgus monkey′s partial biochemical indexes

2.5.2 抗藥抗體檢測

表2顯示，第2次給藥前（第7天），各組食蟹猴均未檢測到抗藥抗體；第3次給藥前（第14天），阿達(dá)木單抗對照組、抗-hTNF-α FHMA 2和10 mg·kg-1組各有2/8，8/8和1/8的食蟹猴檢測到抗藥抗體，抗體最高滴度為1∶6400；隨著給藥次數(shù)的增加，檢測到抗藥抗體的食蟹猴數(shù)和抗體滴度有所增加，至第5次給藥前（第28天），阿達(dá)木單抗對照組、抗-hTNF-α FHMA 2和10 mg·kg-1組各有4/8，8/8 和4/8的食蟹猴檢測到抗藥抗體，抗體最高滴度為1∶25 600；至恢復(fù)期結(jié)束時，各給藥組檢測到抗藥抗體的動物數(shù)和抗體滴度均有所降低?？?hTNF-αFHMA 50 mg·kg-1組僅1只食蟹猴于第4次給藥前（第21天）產(chǎn)生低滴度抗藥抗體（1∶100）。同等劑量下，阿達(dá)木單抗對照組和抗-hTNF-α FHMA組的抗藥抗體產(chǎn)生情況基本一致。

Tab.2 Serum anti-drug antibody titers in cynomolgus monkeys of each group after anti-hTNF-α FHMA sc injection

2.5.3 抗體中和活性檢測

阿達(dá)木單抗對照組食蟹猴（編號13-3600和13-3606），抗-hTNF-α FHMA 2 mg·kg-1組食蟹猴（編號13-3609和13-3614），10 mg·kg-1組食蟹猴（編號13-3617）在首次給藥前血清中均無中和抗體，末次給藥前血清中存在中和抗體，其中阿達(dá)木單抗組13-3600號抗藥抗體于1∶1600稀釋時即可完全中和阿達(dá)木單抗，13-3606號抗藥抗體于1：800稀釋度時開始產(chǎn)生中和作用；抗-hTNF-α FHMA 2 mg·kg-1組2只食蟹猴產(chǎn)生的抗藥抗體均從1∶800稀釋度開始可完全中和阿達(dá)木單抗，10 mg·kg-1組13-3617號抗藥抗體于1∶1600稀釋度開始出現(xiàn)中和作用，1∶800即可到達(dá)完全中和。圖1表明食蟹猴體內(nèi)產(chǎn)生的抗藥抗體具有中和活性。

2.5.4 細(xì)胞因子檢測

與同期陰性對照組相比，第30天抗-hTNF-α FHMA 2 mg·kg-1組IFN-γ降低，10 mg·kg-1組IL-5升高，50 mg·kg-1組IL-4，IL-5，TNF-α和IFN-γ升高（P＜0.05）（表3）。但細(xì)胞因子的改變幅度小且未見明顯規(guī)律性，故認(rèn)為不具有毒理學(xué)意義。

2.5.5 血清免疫球蛋白檢測

與同期陰性對照組相比，各組食蟹猴的IgM和IgA均未見有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。抗-hTNF-α FHMA各劑量組的IgG于第30天升高（P＜0.05）。由于注射的單抗為IgG1，此IgG的升高可能與本實驗所給予的單克隆抗體相關(guān)。

Fig.1 Neutralizing activity detection of high titer anti-drug antibody in cynomolgus monkeys.Five cynomolgus monkeys in which anti-drug antibody titers were higher were taken.A and B：animal number in adalimumab group，13-3600 and 13-3606；B，C and D：animal number in anti-hTNF-α FHMA 2 mg·kg-1group 13-3609，13-3614 and 10 mg·kg-1group 13-3617.Serum neutralizing antibodies were detected before the first sc injection（D1）and before the last sc injection（D28）.

2.5.6 血清補體檢測

首次給藥前、末次藥后次日和恢復(fù)期結(jié)束，包括陰性對照組在內(nèi)的各組中均有個別食蟹猴的C3高于檢測限，其余多數(shù)食蟹猴均低于檢測限。各個檢測時間點C4均高于檢測限，但與同期陰性對照組比較均未見統(tǒng)計學(xué)意義的差異。

2.6 系統(tǒng)解剖及組織病理學(xué)觀察

與同期陰性對照組相比，各組食蟹猴的臟器重量（絕對臟器重量和相對臟器重量）未見統(tǒng)計學(xué)意義的差異；給藥4周和恢復(fù)期4周結(jié)束，大體解剖觀察和顯微鏡觀察均未見藥品相關(guān)性病理改變；給藥4周（第30天）僅抗-hTNF-α FHMA 2 mg·kg-1組2只食蟹猴的注射局部可見與機械刺激性相關(guān)的皮下出血伴單個核細(xì)胞浸潤，其余食蟹猴均未見異常改變。停藥4周后（第57天），食蟹猴注射局部均未見異常改變。

2.7 毒代動力學(xué)

如圖2所示，首次給藥后各組食蟹猴血漿藥物濃度變化基本一致，且與給藥劑量呈正相關(guān)。第4次給藥后抗-hTNF-α FHMA2 mg·kg-1組血漿藥物濃度明顯低于首次給藥，50 mg·kg-1組血漿藥物濃度略高于首次給藥。毒代動力學(xué)參數(shù)計算結(jié)果見表4。

Tab.3 Effect of anti-hTNF-α FHMA on cynomolgus monkeys′partial cytokines detection

Fig.2 Average plasma drug concentration-time curves of cynomolgus monkeys after injection of anti-hTNF-α FHMA.See Tab.1 for the treatment.Plasma drug concentration detected before the first and fourth sc injection，4 h after the first and fourth sc injection in negative control group.In adalimumab 10 mg·kg-1group，and anti-hTNF-α FHMA 2，10 and 50 mg·kg-1groups，plasma drug concentration detected before and 4，24，48，72，96，120，144 and 168 h after the first sc injection，before and 96 h after the third sc injction，before and 4，24，48，72，96，120，144 and 168 h after the fourth sc injection，two weeks after the last sc injection and the end of the recovery period.A：average plasma drug concentration-time curves of each group after the first sc injection；B：average plasma drug concentration-time curves of each group after the fourth sc injection.±s，n=8.

Tab.4 Comparision of toxicokinetics parameters of adalimumab and anti-hTNF-α FHMA

3 討論

長期毒性實驗是非臨床安全性評價的重要內(nèi)容，可以預(yù)測藥物可能引起的臨床不良反應(yīng)，判斷受試物重復(fù)給藥的毒性靶器官或靶組織，確定未觀察到臨床不良反應(yīng)的劑量水平（NOAEL），推測臨床試驗的起始劑量，為后續(xù)臨床試驗提供安全劑量范圍以及為臨床不良反應(yīng)監(jiān)測及防治提供參考［10］?？?hTNF-α FHMA是阿達(dá)木單抗的生物類似藥，故本實驗設(shè)立阿達(dá)木單抗對照組，對其進行毒性、毒代及免疫原性的對比實驗研究。

一般毒理指標(biāo)如觀察、體質(zhì)量、體溫、心電圖、血細(xì)胞計數(shù)、凝血功能、血液生化、尿液和眼科檢查等指標(biāo)均未見與抗-hTNF-α FHMA相關(guān)的異常改變。一般藥理指標(biāo)如動物精神狀態(tài)、行為活動、體溫、呼吸和心電圖等均未見異常，故認(rèn)為抗-hTNF-α FHMA對食蟹猴的神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)均無明顯影響。

免疫毒性指標(biāo)白細(xì)胞絕對計數(shù)及分類計數(shù)、補體、免疫球蛋白水平及白蛋白/球蛋白比值，淋巴器官/組織的大體解剖觀察，胸腺、脾臟器系數(shù)，以及胸腺、脾、淋巴結(jié)、骨髓等臟器的組織學(xué)檢查均未見給藥相關(guān)的異常改變。淋巴細(xì)胞亞群分布以及作為Th1及Th2類細(xì)胞因子代表的IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5，IL-6和TNF-α檢測，均未見與給藥相關(guān)的規(guī)律性改變。

抗-hTNF-α FHMA和阿達(dá)木單抗在食蟹猴體內(nèi)都能引起抗藥抗體的產(chǎn)生，且產(chǎn)生的抗藥抗體具有中和活性?？顾幙贵w從第3次藥前（第14天）開始檢測到，抗-hTNF-α FHMA 2 mg·kg-1組所有8只食蟹猴均產(chǎn)生抗藥抗體；阿達(dá)木單抗對照組和抗-hTNF-α FHMA 10 mg·kg-1組分別有2/8和1/8食蟹猴檢測到抗藥抗體，抗體最高滴度分別為1∶400和1∶100，至末次藥前（第28天），兩組均有4/8食蟹猴檢測到ADA，最高滴度均為1∶25 600，表明在10 mg·kg-1時，抗-hTNF-α FHMA和阿達(dá)木單抗注射液對食蟹猴的免疫原性相似；而50 mg·kg-1組僅1只食蟹猴于第4次給藥前（第21天）產(chǎn)生低滴度抗藥抗體（1∶100）。對于2 mg·kg-1組全部產(chǎn)生抗藥抗體，10 mg·kg-1組和阿達(dá)木單抗對照組均半數(shù)食蟹猴產(chǎn)生抗藥抗體，而50 mg·kg-1組僅1只食蟹猴產(chǎn)生抗藥抗體的原因，認(rèn)為可能與給藥劑量有關(guān)，給藥劑量越大血藥濃度越高，可能干擾抗體檢測結(jié)果。

同樣，抗藥抗體的產(chǎn)生也會影響血藥濃度的檢測結(jié)果。抗-hTNF-α FHMA首次給藥后各組食蟹猴血漿藥物濃度變化基本一致，且與給藥劑量呈正相關(guān)。第4次給藥后2 mg·kg-1組所有食蟹猴均有抗藥抗體產(chǎn)生，血漿藥物濃度明顯低于首次給藥；10 mg·kg-1組和阿達(dá)木單抗對照組雖然平均血藥濃度變化不大，但產(chǎn)生抗藥抗體的食蟹猴血漿藥物濃度明顯低于同組其他食蟹猴?？?hTNF-α FHMA 2，10和50 mg·kg-1組給藥劑量比為1∶5∶25，首次藥后cmax和AUClast比分別為1∶4.79∶22.87和1∶4.61∶22.52，在體內(nèi)基本呈線性動力學(xué)特征。相同劑量下（10 mg·kg-1），抗-hTNF-αFHMA 10 mg·kg-1組和阿達(dá)木單抗對照組比較毒代動力學(xué)參數(shù)無顯著差異。第4次給藥后由于受到抗藥抗體的影響，Tmax，cmax和AUClast數(shù)值僅供參考，無法提供蓄積因子。

綜上，在本實驗條件下，抗-hTNF-α FHMA各劑量組食蟹猴未見明顯全身毒性反應(yīng)，NOAEL為50 mg·kg-1，相當(dāng)與臨床擬用劑量（0.67 mg·kg-1）的75倍；在2～50 mg·kg-1劑量范圍內(nèi)，抗-hTNF-α FHMA在體內(nèi)AUC隨給藥劑量呈正比增加，基本呈線性動力學(xué)特征；在相同給藥劑量下，抗-hTNF-α FHMA與阿達(dá)木單抗具有相似的藥物代謝特征和免疫原性。

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（本文編輯：齊春會）

Long-term toxicity of fully humanized anti-human tumor necrosis factor-α monoclonal antibody for injection in cynomolgus monkeys

ZHANG Nan，WANG Jiong，ZHANG Ya-ting，SONG Gang，ZHAN Shan-shan，PAN Yong-bing
（Department of Antibody Research，Wuhan Institute of Biological Products Co.，Ltd.，Wuhan 430207，China）

OBJECTlVE To evaluate the long-term toxicity of fully human anti-human tumor necrosis factor-α monoclonal antibody（anti-hTNF-α FHMA）for injection in cynomolgus monkeys.METHODS Forty cynomolgus monkeys were randomly divided into 5 groups（4 males and 4 females in each group）：negative control group，adalimumab 10 mg·kg-1group，anti-hTNF-α FHMA 2，10 and 50 mg·kg-1groups.Cynomolgus monkeys in each group were injected sc once a week for 5 consecutive times，followed by 4 weeks of recovery.During the test，general clinical observation，body mass，body temperature，electrocardiogram（ECG），hematology，coagulation function，blood biochemistry，urine，ophthalmology，immune index，and pathological changes in organs and tissues were observed.At the same time，plasma drug concentrations were detected and the toxicokinetics parameters were analyzed. RESULTSNo significant toxicological changes related to drugs were observed in general clinical observation，body mass，body temperature，ECG，ophthalmic examination，blood cell counts，coagulation function，blood biochemistry，urine analysis，lymphocyte subsets，cytokines，serum immunoglobulin，serum complement.Neutralizing anti-drug antibody（ADA）could be detected in adalimumab group and anti-hTNF-α FHMA groups.Anti-hTNF-α FHMA showed linear dynamic characteristics in cynomolgus monkeys.At the same dose（10 mg·kg-1），anti-hTNF-α FHMA had similar immunogenicity and kinetics characteristics to adalimumab.CONCLUSlON The level of anti-hTNF-α FHMA at which no adverse effect was observed was 50 mg·kg-1，which is equivalent to 75 times clinical dosage of quasi （0.67 mg·kg-1），which suggests that anti-hTNF-α FHMA be safe in clinical use.

monoclonal antibodies；tumor necrosis factor-α；adalimumab；Macaca fascicularis；toxicity tests

The project supported by National Science and Technology Major Project（2011ZX09506-005）

PAN Yong-bing，E-mail：yongbingpan@163.com

R965.3

A

1000-3002（2015）06-0945-09

國家科技重大專項（2011ZX09506-005）

張 囡，女，副研究員，主要從事治療性單克隆抗體研發(fā)工作，E-mail：zhnan1122@163.com

潘勇兵，E-mail：yongbingpan@163.com

（2015-03-20 接受日期：2015-11-16）