陳 聰，劉 芳，張 聰，陳順華，曹立宇，尹 玉

IL-12p40、IL-12p70在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤中的表達及意義

陳 聰1，2，劉 芳3，張 聰1，2，陳順華1，2，曹立宇1，2，尹 玉1，2

目的 探討白細胞介素-12p40（IL-12p40）、白細胞介素-12p70（IL-12p70）在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤（CHL）組織中的表達及意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測IL-12p40、IL-12p70在41例CHL組織、92例彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）組織及20例反應(yīng)性淋巴組織增生（RLH）中的表達。結(jié)果 IL-12p40、IL-12p70在41例CHL及92例DLBCL中的陽性表達率分別是 51.22%、70.73%及0.00%、4.35%，20例RLH中未見IL-12p40及IL-12p70表達。IL-12p40、IL-12p70在CHL中及各亞型中的表達均明顯高于DLBCL及RLH（P＜0.05）。IL-12p40及IL-12p70的表達與患者性別、年齡、腫塊大小、B癥狀、臨床分期、血清乳酸脫氫酶水平、國際預(yù)后評分等臨床病理因素均無關(guān)。IL-12p40與IL-12p70在CHL中的表達有相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論 IL-12p40、IL-12p70在CHL發(fā)病中有重要作用。

霍奇金淋巴瘤;彌漫性大B細胞淋巴瘤;IL-12p40;IL-12p70;免疫組織化學(xué)

經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤（classical Hodgkin lymphoma，CHL）是一種常見的淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，占所有霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）病例的95%以上［1］;其組織學(xué)特點為少數(shù)的腫瘤細胞—Hodgkin細胞和 Reed-Sternberg細胞（HRS細胞）浸潤于大量的炎性背景細胞，其中腫瘤性HRS細胞只占1%～5%。該病的發(fā)病機制尚未完全明了，目前認為CHL中的腫瘤細胞絕大多數(shù)起源于生發(fā)中心B細胞，其發(fā)病與病毒感染、細胞因子及信號傳導(dǎo)通路異常等多種因素有關(guān)。彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是一種異質(zhì)性的侵襲性B細胞淋巴瘤，根據(jù)免疫組化及分子遺傳學(xué)不同可分為多種亞型，其治療方法及預(yù)后與CHL不同。白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）是一種有多種免疫調(diào)節(jié)功能的異源二聚體細胞因子，由p35及p40兩個亞基通過二硫鍵連接而成，主要由樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、單核巨噬細胞、B細胞以及其他的抗原提呈細胞產(chǎn)生［2］，能促進CD4+T輔助細胞（Th1）的增殖，誘導(dǎo)NK細胞和T細胞產(chǎn)生細胞因子，在感染免疫、腫瘤免疫及自身免疫性疾病中起重要作用。關(guān)于IL-12不同亞基成分在淋巴瘤中的表達鮮有報道。該實驗采用免疫組織化學(xué)法檢測IL-12p40、IL-12p70在CHL、DLBCL組織中的表達，探討其在CHL及DLBCL組織發(fā)病中的作用及臨床意義，為CHL與DLBCL的鑒別診斷及治療提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2006年1月～2013年12月診斷及分型均明確的CHL病例41例，其中男25例，女16例;發(fā)病年齡5 ～80（33.76 ±17.14）歲。所有病例參照文獻［3］進行組織形態(tài)學(xué)分型，其中結(jié)節(jié)硬化型CHL（nodular sclerosis classical Hodgkin lymphoma，NSCHL）22例，混合細胞型 CHL（mixed cellularity classical Hodgkin lymphoma，MCCHL）12例，淋巴細胞豐富型CHL（lymphocyte-rich classical Hodgkin lymphoma，LRCHL）7例，淋巴細胞消減型CHL（lymphocyte-depleted classical Hodgkin lymphoma，LDCHL）0例。DLBCL病例92例，其中男61例，女31例;發(fā)病年齡14～90（56.52±15.13）歲。另選20例反應(yīng)性淋巴組織增生（reactive lymphoid hyperplasia，RLH）作為對照。所有病例經(jīng)2位病理專家復(fù)診。所有標本經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，分別作HE、免疫組化及原位雜交染色。

1.1.2 主要試劑 兔抗人IL-12p40（ab106270）多克隆抗體購自香港Abcam公司;鼠抗人IL-12p70（sc-74150）單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;免疫組織化學(xué)二步法染色試劑盒、檸檬酸修復(fù)液（pH6.0）及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法 免疫組織化學(xué)（EnVision二步法）及原位雜交染色按試劑盒說明書操作，用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定標準 IL-12p40、IL-12p70免疫組化染色表達主要定位于細胞質(zhì)，細胞質(zhì)呈棕黃色者為陽性，血管內(nèi)皮細胞陽性作為內(nèi)對照;EB病毒（epstein-barr virus，EBV）編碼的小 RNA（Epstein-Barr encoded RNAs，EBER）陽性定位于細胞核，細胞核呈棕黃色者為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗或校正的χ2檢驗及Fisher精確概率法比較各組間的差異，相關(guān)性分析采用二分類變量之間的Pearson關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果

2.1 IL-12p40、IL-12p70 在 CHL、DLBCL 及 RLH中的表達 CHL病理診斷及亞型均經(jīng)組織學(xué)、免疫組化及原位雜交染色證實（圖1）。IL-12p40及IL-12p70定位于細胞質(zhì)中，CHL中可見腫瘤性HRS細胞表達，非腫瘤性細胞不表達（圖2）。IL-12p40在NSCHL、MCCHL、LRCHL、CHL 中的表達率分別是50.00%、41.67%、71.43%、51.22%。IL-12p40總體陽性率有差異，NSCHL、CHL與 DLBCL比較（χ2=45.339、55.957，P＜ 0.001），MCCHL、LRCHL 與DLBCL 比較（Fisher χ2，P＜0.001）;NSCHL 與 RLH比較（χ2=13.548，P＜0.001），MCCHL與RLH 比較（χ2=6.969，P=0.008），LRCHL、CHL 與 RLH 比較（χ2=13.118、15.622，P＜ 0.001）。IL-12p70 在NSCHL、MCCHL、LRCHL、CHL 中的表達率分別是81.82%、58.33%、57.14%、70.73%，IL-12p70 總體陽性率有差異，NSCHL、MCCHL、CHL與 DLBCL比較（χ2=63.535、27.251、66.994，P＜ 0.001），LRCHL 與 DLBCL 比 較（Fisher χ2，P＜ 0.001）;NSCHL與 RLH 比較（χ2=28.636，P＜0.001），MCCHL 與 RLH 比較（χ2=11.715，P=0.001），LRCHL與RLH 比較（χ2=9.270，P=0.002），CHL 與 RLH比較（χ2=26.966，P＜0.001）。IL-12p40及 IL-12p70在CHL及其亞型中的表達率均明顯高于DLBCL 及 RLH（χ2=67.209、79.916，P＜0.05），見表1。

2.2 CHL中IL-12p40、IL-12p70表達與臨床病理因素間的關(guān)系 IL-12p40及IL-12p70表達與患者性別、年齡、腫塊大小、B癥狀（發(fā)熱、乏力、消瘦、盜汗、皮膚瘙癢等）、臨床分期、血清乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平、國際預(yù)后評分（international prognostic score，IPS）等臨床病理因素均無關(guān)，見表2。

表1 IL-12p40、IL-12p70在CHL、DLBCL及RLH中的表達［n（%）］

表2 CHL中IL-12p40、IL-12p70表達與臨床病理因素之間的關(guān)系

2.3 CHL中IL-12p40與IL-12p70表達之間的關(guān)系 21例IL-12p40陽性CHL病例中，IL-12p70陽性18例，陰性3例;20例IL-12p40陰性CHL病例中，IL-12p70陽性11例，陰性9例。Pearson關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，IL-12p40、IL-12p70在CHL中的表達有相關(guān)性（r=0.337，P=0.031）。

3 討論

HL發(fā)病率在我國約占淋巴瘤總數(shù)的8%［4］，治療效果好，治愈率可達80% ～90%，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。文獻［3］顯示絕大多數(shù)（＞98%）CHL中的HRS細胞起源于生發(fā)中心階段分化成熟的B細胞，極少數(shù)起源于胸腺后外周T細胞。IL-12首先從EBV轉(zhuǎn)染的人B淋巴母細胞系RPMI-8866的上清液中發(fā)現(xiàn)，被命名為自然殺傷細胞刺激因子（natural killer cell stimulatory factor，NKSF）［5］，隨后又從EBV轉(zhuǎn)化的B細胞系NC37上清液中發(fā)現(xiàn)，被命名為細胞毒淋巴細胞成熟因子（cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF）［6］，完全純化兩者并克隆基因后，顯示NKSF和CLMF是同一種細胞因子，并命名為現(xiàn)在的IL-12。IL-12是由分子量為40 ku的p40亞基及分子量為35 ku的p35亞基通過二硫鍵連接形成的分子量為70 ku的異二聚體（p70）細胞因子。在產(chǎn)生IL-12的細胞中，p35只作為IL-12的一個亞基，隨p70一起表達;p40除隨p70一起表達外，還能夠單獨表達。單獨的p40沒有生物活性，而只有與p35結(jié)合形成異二聚體p70才具有生物學(xué)活性［7］。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測IL-12p40及IL-12p70在 CHL組織中的表達，數(shù)據(jù)顯示 IL-12p40、IL-12p70在CHL組織中表達的陽性率均顯著高于DLBCL及RLH，提示IL-12在CHL發(fā)病中起重要作用。盡管絕大多數(shù)CHL被認為是B細胞起源的腫瘤，但常用的B系標志物（如CD20）在HRS細胞的陽性表達率不高，Pax-5常為弱陽性表達，而典型的DLBCL中CD20、Pax-5常強陽性表達，推測其發(fā)病機制可能與DLBCL不同。2008版WHO分類方案［3］表明HRS細胞中EBV的感染率與 CHL的組織學(xué)亞型有關(guān)，其中MCCHL亞型EBV感染率最高，約為75%。本研究CHL中LMP-1/EBER表達率為48.8%，其表達與 IL-12p40及 IL-12p70有關(guān)，提示EBV感染在CHL發(fā)病中起重要作用。

Schwaller et al［8］應(yīng)用免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)大部分的CHL病例中HRS細胞周圍聚集有IL-12免疫反應(yīng)陽性的小淋巴細胞，而HRS細胞中未見IL-12表達，這樣的病例被認為IL-12陽性，其陽性率為82%，在非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）、非腫瘤性的淋巴組織病變以及部分CHL中僅有散在的少數(shù)IL-12免疫反應(yīng)陽性的小淋巴細胞，這些病例被認為IL-12陰性，并且所有EBV陽性的CHL病例也表達IL-12，而在所有NHL病例中未檢測到LMP-1的表達。該研究認為在HRS細胞中不表達IL-12，是因為這些細胞是大量細胞因子的已知來源，而細胞因子的作用是雙向的，在周圍T細胞中表達的IL-12可能對HRS細胞的生物學(xué)功能有重要影響。Schwaller et al［8］認為大多數(shù) CHL表達IL-12表明其可能在HL的發(fā)病中起重要作用，提示該細胞因子與EBV陽性的HL有關(guān)。

CHL患者除淋巴結(jié)進行性腫大外還經(jīng)常伴有發(fā)熱、體重減輕、盜汗等B癥狀，推測腫瘤可能分泌細胞因子。研究［9］顯示HRS細胞能分泌多種細胞因子，如 IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β等。由于絕大多數(shù)HRS細胞是起源于B細胞的，而IL-12是從EBV感染的B淋巴母細胞中發(fā)現(xiàn)的，關(guān)于IL-12通過EBV的介導(dǎo)在B細胞中表達已有文獻［10］報道。本研究HRS細胞胞質(zhì)中有IL-12的表達，提示HRS細胞可能分泌IL-12作用于自身及周圍T細胞，誘導(dǎo)Th0細胞向Th1細胞分化，啟動細胞免疫應(yīng)答。IL-12在CHL中的表達與臨床因素的關(guān)系還不清楚，本研究結(jié)果顯示IL-12p40及IL-12p70表達與患者性別、年齡、腫塊大小、B癥狀、臨床分期、LDH水平、IPS評分等臨床病理因素均無關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示IL-12在HL中高表達，提示IL-12在CHL發(fā)病中起重要作用，可能為CHL的免疫治療提供新的實驗依據(jù)。

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Expression and significance of IL-12p40 and IL-12p70 in classical Hodgkin lymphoma

Chen Cong1，2，Liu Fang3，Zhang Cong1，2，et al（1Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei230032;2The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022;3Dept of Pathophysiology，Medical College of Foshan University，F(xiàn)oshan528000）

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of interleukin-12p40（IL-12p40）and interleukin-12p70（IL-12p70）in patients with classical Hodgkin lymphoma（CHL）.MethodsIL-12p40 and IL-12p70 were stained by immunohistochemical EnVision two-step method in 41 cases of CHL，92 cases of DLBCL and 20 cases of reactive lymphoid hyperplasia（RLH）.ResultsThe positive rates of IL-12p40 and IL-12p70 were 51.22%，70.73%in CHL and 0.00%，4.35%in DLBCL，no expression of IL-12 was observed in RLH.The expression rates of IL-12p40 and IL-12p70 in CHL were significantly higher than that in DLBCL and RLH（P＜0.05）.There was no significant correlation between IL-12p40 and IL-12p70 with sex，age，bulky disease，B symptom，clinic stage，serum LDH level，and international prognostic score.IL-12p40 was positively correlated with the expression of IL-12p70 in CHL（P＜0.05）.ConclusionThe IL-12p40 and IL-12p70 play important roles in the pathogenesis of CHL.

classical Hodgkin lymphoma;diffuse large B-cell lymphoma;IL-12p40;IL-12p70;immunohistochemistry

R 733.4

A

1000－1492（2015）09－1308－05

2015－05－08接收

安徽高校省級自然科學(xué)研究項目（編號:KJ2013A150）

1安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，合肥 230022

3佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理病生教研室，佛山528000

陳 聰，女，碩士研究生;

曹立宇，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail:caoliyuhf@163.com