劉　源，李詩雯，彭銘燁，曹約澤，付彩霞，高　冰，汪　超，李冬生，徐　寧*（.湖北工業(yè)大學 生物工程學院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心，湖北 武漢 40068；.湖北順溪生物食品股份有限公司，湖北 十堰 4400；.湖北土老憨調味食品股份有限公司，湖北 宜昌 44000）

不同生化因子對米曲霉蛋白酶系活力的影響

劉源1，李詩雯1，彭銘燁1，曹約澤2，付彩霞3，高冰1，汪超1，李冬生1，徐寧1*
（1.湖北工業(yè)大學 生物工程學院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心，湖北 武漢 430068；
2.湖北順溪生物食品股份有限公司，湖北 十堰 442300；3.湖北土老憨調味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

研究不同生化因子（金屬離子、乙二胺四乙酸（EDTA）和十二烷基磺酸鈉（SDS））對米曲霉蛋白酶系（包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶等5種）活力的影響，結果顯示：生化因子都對羧肽酶活力有促進作用，影響最強的是Ca2+，其相對酶活達到310%；對酸性蛋白酶活力促進作用最強的是的Mn2+，相對酶活達到317%；而SDS完全抑制其活性。生化因子對中性蛋白酶、堿性蛋白酶和氨肽酶活力主要起抑制作用，抑制能力最強的分別是Ge2+，F(xiàn)e3+和SDS。Ag+對氨肽酶活力促進顯著，相對酶活力達到483%。

米曲霉；蛋白酶；生化因子；酶活力

米曲霉（Aspergi11us oryzae）是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的主要釀造微生物，其具有優(yōu)良的胞外酶系分泌和食品安全性［1-2］。米曲霉蛋白酶將蛋白質原料分解為多肽和氨基酸增強發(fā)酵食品的營養(yǎng)和風味，在醬油、豆醬、腐乳、多肽制備等食品發(fā)酵工業(yè)領域具有廣泛的應用［3-7］。米曲霉蛋白酶根據酶切方式可分為內切酶和外切酶兩大類，其中內切酶包括中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶三類，外切酶包括羧肽酶和氨肽酶兩類，并且每個類別又由多種蛋白酶組成［8-12］。不同的蛋白酶活力受金屬離子影響有差別，可表現(xiàn)為激活或抑制，米曲霉固態(tài)培養(yǎng)所產蛋白酶系受金屬離子和酶抑制劑的影響還未見系統(tǒng)的報道。本研究以米曲霉固態(tài)培養(yǎng)產生的龐大胞外蛋白酶系為基礎，將酶進行粗提，研究多種金屬離子和酶抑制分別對蛋白酶系中5種蛋白酶活力的影響，獲得這些生化因子與蛋白酶活力激活與抑制的關系，為揭示米曲霉蛋白酶系的酶學特征奠定基礎，同時為生產中米曲霉蛋白酶系的調節(jié)和優(yōu)化提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

米曲霉（Aspergi11us oryzae）AS 3.951（滬釀3.042）：湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心保藏。聚乙二醇20 000、L-亮氨酸-對硝基苯胺、酪蛋白、十二烷基磺酸鈉（sodiumdodecy1 su1fate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethy1ene diamine tetraacetic acid，EDTA）：國藥集團化學有限公司；Cbz-GLu-Tyr：日本和光純藥WAKO公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；ZAD-1270生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造公司；WFJ2000紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司。1.3方法

1.3.1米曲霉發(fā)酵培養(yǎng)

培養(yǎng)基配方：麩皮/面粉/米粉=8∶1∶1，添加1倍質量蒸餾水，121℃滅菌20 min。30 g滅菌的培養(yǎng)基（500 mL三角瓶中）中接種一環(huán)米曲霉孢子，溫度30～32℃，靜置培養(yǎng)72 h。

1.3.2蛋白酶粗酶液的制備

取一定質量米曲霉發(fā)酵產物，研磨成粉末，加入4倍水，40℃水浴1 h后，濾紙過濾收集濾液，8 000 r/min離心30 min，取上清液。硫酸銨沉淀（飽和度70%，4℃、12 h）后，去除上清液，用1倍體積的蒸餾水溶解沉淀，置于截留分子質量5 000 u透析袋中，4℃蒸餾水透析24 h，聚乙二醇20 000濃縮30 min，所得溶液即為蛋白酶粗酶液。

1.3.3生化因子處理粗酶液

分別取不同生化因子（Fe3+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Ge2+、Ag+、Zn2+、EDTA、SDS）溶液與粗酶液混合，使最終濃度分別為2 mmo1/L、5 mmo1/L和10 mmo1/L，分別測定酶溶液的中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶5種酶的活力。將未處理的酶液的酶活定義為100%，相對酶活為5種酶的活力與未處理的酶液的酶活之比。

1.3.4測定方法

蛋白酶（中性、酸性和堿性）活力測定方法參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林法［13］；氨肽酶活力測定參考文獻［14］；羧肽酶活力測定參考文獻［15］。

2　結果與分析

2.1Fe3+對米曲霉蛋白酶系活力的影響

圖1　不同濃度Fe3+對米曲霉蛋白酶系活力的影響Fig.1 Effect of different Fe3+concentration on proteases activity ofA.oryzae

米曲霉的蛋白酶系活力受Fe3+的影響如圖1所示。堿性蛋白酶完全被Fe3+抑制，酶活力未檢出。酸性蛋白酶、中性蛋白酶和氨肽酶活力受Fe3+的抑制明顯，其最小相對酶活分別為10%、3%、6%，F(xiàn)e3+濃度越高，其酶活力越低，基本呈梯度下降趨勢。相反，F(xiàn)e3+對羧肽酶活力有促進作用，F(xiàn)e3+濃度為2 mmo1/L時，羧肽酶相對活力最高，為131%；但隨著Fe3+濃度的升高，羧肽酶活力呈梯度下降趨勢。

2.2Fe2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響

Fe2+對米曲霉蛋白酶活力影響如圖2所示。較低濃度的Fe2+對酸性蛋白酶有一定的促進作用，當Fe2+濃度為2 mmo1/L時，相對酶活力達到143%，隨著濃度的升高，相對蛋白酶活力降低。而Fe2+對中性蛋白酶、堿性蛋白酶有較強的抑制作用，F(xiàn)e2+濃度越大，其相對酶活力越低，抑制能力最強的相對酶活力分別為4%和7%。對于氨肽酶，隨著Fe2+濃度的增加，相對酶活力先增高后降低，但整體起抑制作用，抑制能力最強的是2 mmo1/L Fe2+，相對酶活力達到37%。對于羧肽酶，F(xiàn)e2+對其起促進作用，并隨著Fe2+濃度的增加先增加再降低，其最高相對酶活力達到147%。

圖2　不同濃度Fe2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響Fig.2 Effect of different Fe2+concentration on proteases activity ofA.oryzae

2.3Zn2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響

圖3　不同濃度Zn2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響Fig.3 Effect of different Zn2+concentration on proteases activity ofA.oryzae

Zn2+對米曲霉蛋白酶系的影響如圖3所示。Zn2+對米曲霉蛋白酶系整體表現(xiàn)為促進作用。Zn2+在一定濃度范圍內對5種蛋白酶都具有促進作用，尤其是對羧肽酶促進作用最大。當Zn2+濃度為5 mmo1/L時，酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、羧肽酶酶及氨肽酶相對酶活力分別為160%、130%、121%、225%、90%。當Zn2+濃度達到10mmo1/L時，羧肽酶相對酶活力達到193%，氨肽酶相對酶活力為143%。

2.4Mn2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響

Mn2+對米曲霉蛋白酶系的影響如圖4所示。其中對酸性蛋白酶具有很強的促進作用，相對酶活力最高達到317%。不同濃度的Mn2+對中性蛋白酶酶活力具有不同的作用，在濃度為2 mmo1/L時，其抑制酶活力，相對酶活力為67%，隨著濃度的提高，抑制效果越弱，當濃度達到10 mmo1/L時，Mn2+對中性蛋白酶活力幾乎無影響，相對酶活力為97%。其對堿性蛋白酶活力無明顯影響；Mn2+對米曲霉氨肽酶和羧肽酶也具有較強的促進作用。

2.5Cu2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響

圖5　不同濃度Cu2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響Fig.5 Effect of different Cu2+concentration on proteases activity ofA.oryzae

Cu2+對米曲霉的酶活力影響如圖5所示。對于酸性蛋白酶，Cu2+有很強的促進作用，最高達到218%。隨著Cu2+濃度的增加，中性蛋白酶相對酶活力梯度下降，10 mmo1/L時相對酶活力最小，為9%，堿性蛋白酶活也受到抑制，在5 mmo1/L時，酶基本失活；氨肽酶也隨著Cu2+濃度的增加，其相對酶活力先降低后平穩(wěn)，當Cu2+濃度達到10 mmo1/L時，相對酶活力只有18%。Cu2+濃度在2 mmo1/L對羧肽酶相對酶活力為170%，濃度升高反而表現(xiàn)較強的抑制作用。

2.6Ca2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響

Ca2+對米曲霉蛋白酶系的影響如圖6所示。Ca2+對米曲霉酶活力也具有一定的影響，其中對于酸性蛋白酶，在較低濃度時，酶活力無明顯變化，達到10 mmo1/L時，相對酶活力下降到65%；對于中性蛋白酶，在較低濃度2 mmo1/L時，其相對酶活力降低力到77%，當Ca2+濃度提高時，其酶活力提高，相對酶活力接近于100%；對于堿性蛋白酶，其相對酶活力是先增加后下降，最高為117%；其對羧肽酶有著最大的促進作用，當Ca2+濃度為2 mmo1/L時，相對酶活力達到310%，隨著濃度的增加，相對酶活力略微下降；Ca2+對于氨肽酶為促進作用，最高的相對酶活力達到185%。

圖6　不同濃度Ca2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響Fig.6 Effect of different Ca2+concentration on proteases activity ofA.oryzae

2.7Ag+對米曲霉蛋白酶系活力的影響

圖7　不同濃度Ag+對米曲霉蛋白酶系活力的影響Fig.7 Effect of different Ag+concentration on proteases activity ofA.oryzae

Ag+對米曲霉蛋白酶系的影響如圖7所示。Ag+對米曲霉蛋白酶酶活力的影響主要起抑制作用。對于中性蛋白酶，隨著Ag+濃度增加，其相對酶活力梯度降低，相對酶活力由52%降至9%；堿性蛋白酶也梯度下降，相對酶活力從67%降至0；酸性蛋白酶，相對酶活力從42%降至21%。而對于羧肽酶而言，2 mmo1/L時Ag+對其起促進作用，其相對酶活力最高為171%，而5 mmo1/L和10 mmo1/L時，Ag+對其相對酶活力有一定的抑制作用，其相對酶活力分別為81%和70%；對于氨肽酶來說，在較低濃度的Ag+作用下，其相對酶活力降至47.7%，隨著Ag+濃度的提高，Ag+對氨肽酶酶活力表現(xiàn)出促進作用，當Ag+濃度達到10 mmo1/L時，其相對酶活力達到483%。

2.8Ge2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響

Ge2+對米曲霉蛋白酶系的影響如圖8所示。Ge2+對米曲霉蛋白酶的影響主要表現(xiàn)在抑制作用，隨著Ge2+濃度的增加，其酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶的相對酶活力梯度下降，對于酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶其酶活力幾乎都被抑制。對于羧肽酶，其表現(xiàn)為促進作用，但隨著Ge2+濃度的提高，相對酶活逐漸下降，最高的相對酶活力達到315.5%。氨肽酶的相對酶活在2 mmo1/L的Ge2+條件下，無明顯影響，但Ge2+濃度升高時，最低的相對酶活力為53.9%。

圖8　不同濃度Ge2+對米曲霉蛋白酶系活力的影響Fig.8 Effect of different Ge2+concentration on proteases activity ofA.oryzae

2.9EDTA對米曲霉蛋白酶系活力的影響

圖9　不同濃度EDTA對米曲霉蛋白酶系活力的影響Fig.9 Effect of different EDTA concentration on proteases activity ofA.oryzae

EDTA對米曲霉蛋白酶系的影響如圖9所示。EDTA對米曲霉蛋白酶活力具有一定的影響，其中，對酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、氨肽酶都具有一定的抑制作用，中性蛋白酶、堿性蛋白酶活力抑制最為強烈，最低相對酶活分別為3.3%、13%。對羧肽酶具有很強的促進作用，隨著EDTA濃度的增加，羧肽酶酶活力不斷增加，其相對酶活力達到241%，其對羧肽酶的生產應用具有一定的意義。

2.10SDS對米曲霉蛋白酶系活力的影響

SDS對米曲霉蛋白酶系的影響如圖10所示，SDS對米曲霉蛋白酶酶活力主要起抑制作用。其中酸性蛋白酶活力完全被抑制。中性蛋白酶、堿性蛋白酶和氨肽酶的相對酶活力最高都不超過30%。但對于羧肽酶，當SDS濃度為2 mmo1/L時，其相對酶活力達到159.7%，隨著濃度的提高去相對酶活力降低，相對酶活力最低達到107%。

3　結論

圖10　不同濃度SDS對米曲霉蛋白酶系活力的影響Fig.10 Effect of different SDS concentration on proteases activity of A.oryzae

不同濃度的生化因子對米曲霉蛋白酶系（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶）各個組分酶活力的影響不同。對于羧肽酶活力，除了Cu2+、Ag+高濃度起抑制作用外，均起促進作用。Fe3+、EDTA、Ag+、Ge2+對酸性蛋白酶起著強烈的抑制作用，高濃度的Ca2+和Fe2+對酸性蛋白酶酶活力起抑制作用，SDS對酸性蛋白酶酶活力完全抑制。對于中性蛋白酶活力，Zn2+其有較高的促進作用，Mn2+、Ca2+對其起較小的抑制作用，其他生化因子具有較強的抑制作用。Zn2+、Mn2+、Ca2+對堿性蛋白酶活力有較小的促進作用，F(xiàn)e3+、Cu2+和Ag+高濃度對其具有強烈抑制，而對EDTA、SDS、Fe2+、Ge2+低濃度就可強烈的抑制。對于氨肽酶活力，Ca2+、Mn2+、高濃度的Ag+、Zn2+對其有強烈的促進作用，其他影響因子對氨肽酶有著不同程度的抑制作用。本研究結果進一步闡明了米曲霉固態(tài)培養(yǎng)蛋白酶系的酶學性質，金屬離子和抑制劑對酶活力激活與抑制關系，為米曲霉蛋白酶的工業(yè)化應用提供了理論參考。

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Effect of different biochemica1 reagents on proteases activity ofAspergi11us oryzae

LIU Yuan1，LI Shiwen1，PENG Mingye1，CAO Yueze2，F(xiàn)U Caixia3，GAO Bing1，WANG Chao1，LI Dongsheng1，XU Ning1*
（1.Hubei Research Center of Food Fermentation Engineering and Techno1ogy，Hubei Co11aborative Innovation Center for
Industria1 Fermentation，Co11ege of Bio1ogica1 Engineering，Hubei University of Techno1ogy，Wuhan 430068，China；
2.Hubei Shunxi Bio1ogica1 Food Co.，Ltd.，Shiyan 442300，China；
3.Hubei Tu1aohan F1avouring and Food Co.，Ltd.，Yichang 443000，China）

The effect of different biochemica1 reagents（meta1 ions，EDTA，and SDS）on proteases（acid protease，neutra1 protease，a1ka1ine protease，aminopeptidase and carboxypeptidase）activity ofAspergi11us oryzaewas researched.The resu1ts showed that the a11 biochemica1 reagents cou1d improve the carboxypeptidase activity，Ca2+had the greatest effect on carboxypeptidase activity and the re1ative enzyme activity reached 310%.Mn2+had greatest effect on acid protease activity，and the re1ative enzyme activity reached 317%.The acid protease activity was comp1ete1y inhibited by SDS. Biochemica1 reagents inhibited the activity of neutra1 protease，a1ka1ine protease and aminopeptidase.The biochemica1 reagents with greatest inhibition in order were Ge2+，F(xiàn)e3+and SDS，respective1y.Ag+had significant1y promoting effect on aminopeptidase activity，and the re1ative enzyme activity reached 483%.

Aspergi11us oryzae；protease；biochemica1 reagent；enzyme activity

TS264.2

A

0254-5071（2015）12-0055-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.012

2015-10-20

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（20130500009）；湖北省教育廳項目（Q20141409）；湖北工業(yè)大學博士科研啟動基金（BSQD12147）

劉源（1993-），女，助理工程師，本科，研究方向為生物工程。

徐寧（1979-），男，講師，博士，研究方向為生物工程。