鄧琳瓊 張以忠

摘要：利用化學誘變劑甲基磺酸乙酯 （ethyl methane sulfonate，EMS） 誘變處理苦蕎（Fagopyrum tataricum （L.） Gaertn）種子，對M2代突變材料進行生物學性狀與農(nóng)藝性狀鑒定和分析，M3代材料進一步驗證。結(jié)果表明，試驗獲得了葉片肥大、早熟、晚熟、小粒、矮稈和黃化6種穩(wěn)定遺傳的突變體。葉片肥大、早熟和晚熟突變體的株高、主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)、株粒數(shù)、株粒重和千粒重與對照間均無顯著差異。矮稈突變體的株高和主莖分支數(shù)以及小粒突變體的株粒重和千粒重顯著低于對照，其他性狀與對照間差異不顯著。黃化突變體的株高與對照無顯著差異，主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)、株粒數(shù)、株粒重和千粒重均顯著低于對照。

關(guān)鍵詞：苦蕎（Fagopyrum tataricum （L.） Gaertn）；甲基磺酸乙酯；突變體；農(nóng)藝性狀

中圖分類號：S517 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）14-3343-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.004

Construction and Agronomic Traits Analysis of Mutant Population from Tartary Buckwheat Induced by Ethyl Methane Sulfonate（EMS）

DENG Lin-qiong，ZHANG Yi-zhong

（Ecological Engineering School，Guizhou University of Engineering Science， Bijie 551700， Guizhou， China）

Abstract： The seeds of tartary buckwheat were treated by chemica1 mutagen ethyl methane sulfonate （EMS） to construct a mutant population. The biological and agronomic characters were identified and analyzed in M2 generation. M3 generation materials were further verified. The results showed that six types of stable genetic mutants（big leaf， premature， late maturity， small grain， dwarf and albino plant） were gotten. There were no significant differences for the plant height， the branches of main stem， the nodes of main stem， the seeds per plant， the weight per plant and the 1000-seeds weight between the big leaf mutant， premature mutant and late maturing mutant. The plant height and the branches of main stem of the dwarf mutant and the weight per plant and the 1000-seeds weight of the small grain mutant were significant lower than the control materials， whereas the other characters were no significant differences with the control materials. Though the plant height of the albino plant was no significant differences with the control materials， the branches of main stem， the nodes of main stem， the seeds per plant， the weight per plant and the 1000-seeds weight were significant lower than the control materials.

Key words： tartary buckwheat（Fagopyrum tataricum （L.） Gaertn）；ethyl methane sulfonate；mutants；agronomic traits

突變體是某個性狀發(fā)生可遺傳變異或某個基因發(fā)生突變的材料，是遺傳育種的重要資源，也是開展功能基因研究的重要材料，而且當今功能基因組學所取得的一些成果，也是建立在大量不同類型突變體的基礎(chǔ)之上[1-3]。由于自發(fā)突變產(chǎn)生突變體的頻率非常低，傳統(tǒng)育種技術(shù)周期長，不能滿足當前蕎麥生產(chǎn)對優(yōu)良品種的需求。化學誘變可以大大提高突變頻率，加快新種質(zhì)資源的創(chuàng)制速率。甲基磺酸乙酯（EMS）是目前使用最廣泛、效果最好的化學誘變劑，由于其誘變方法簡便、誘變頻率高、誘變范圍廣、染色體畸變相對較少、可以對作物的某一種特殊性狀及其品質(zhì)進行改良，因多為顯性突變體，易于進行篩選，因此在其他作物上已被廣泛利用[4-6]。

苦蕎（Fagopyrum. tataricum（L.） Gaertn）屬蓼科（Polygnaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill）2個栽培種之一，為一年生草本植物，其營養(yǎng)價值居糧食作物之首，而且還具有較高的藥用價值，屬藥食兩用作物，被營養(yǎng)學家們稱為21世紀最有前途的綠色食品[7-9]。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，具有保健療效的糧用藥用作物蕎麥和蕎麥產(chǎn)品日益受到人們的喜愛和重視，但蕎麥的產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重阻礙了蕎麥的生產(chǎn)及發(fā)展。雖然誘發(fā)突變技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物品種改良，在水稻（Oryza sativa）[10-12]、小麥（Triticum aestivum Linn.）[13-15]、玉米（Zea mays）[16，17]等作物上獲得了一批常規(guī)種質(zhì)資源庫中少見的突變材料，大大加快了傳統(tǒng)作物育種的進程，也為功能作物育種和產(chǎn)品開發(fā)提供了重要技術(shù)手段和種質(zhì)資源。但在蕎麥育種研究方面，突變體研究報道很少，且均為物理方法進行的誘變，主要有李國柱等[18]、田小麗[19]、Yao等[20]、Samo等[21]、Breznik等[22]、王安虎等[23]的報道，這些利用物理方法對蕎麥進行的誘變產(chǎn)生了一些較好的突變體，為蕎麥的進一步研究及開發(fā)提供了一些材料。而利用EMS對蕎麥的誘變研究目前尚未見報道。鑒于此，本研究利用化學誘變劑EMS對貴州地方栽培苦蕎進行處理，對其突變體進行篩選和鑒定，創(chuàng)建苦蕎突變體庫，并對其農(nóng)藝性狀進行研究，以期為蕎麥遺傳育種、開發(fā)及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試苦蕎材料為貴州畢節(jié)苦蕎（編號TA20111008001），來源于貴州工程應(yīng)用技術(shù)學院生態(tài)工程學院蕎麥種子資源庫。

1.2 方法

1.2.1 突變材料創(chuàng)建 選用均勻一致的2 000粒飽滿苦蕎種子，室溫下蒸餾水中浸泡18 h，濾紙吸干表面水分，室溫下用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的化學誘變劑EMS（Sigma公司）處理17 h，自來水沖洗15 h，晾干，2012年7月25日播種于畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)鴨池試驗地（地理位置為東經(jīng)105°16′571″，北緯27°13′322″，海拔1 550 m）。行距0.40 m，粒距0.30 m，田間常規(guī)管理，2012年11月28日單株收獲M1代種子共793份。

1.2.2 M2代的種植與表型性狀調(diào)查 2013年3月31日將793份M2代按株系播種于畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)鴨池試驗地，并設(shè)野生型苦蕎作為對照，行距0.40 m，粒距0.30 m，全生育期每2～4 d進行田間調(diào)查一次，觀察記載幼苗、葉、莖、花、育性、成熟期等性狀，篩選各種形態(tài)突變體。并分別考察其株高、主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)、株粒數(shù)、株粒重、千粒重等。篩選各種形態(tài)性狀變異材料，記錄相應(yīng)變異性狀并編號，成熟后于2013年7月21日單株收獲。

1.2.3 M3代種植與表型性狀調(diào)查 2013年7月31日將在M2代篩選到的形態(tài)變異植株種子按株系（M3）播種于畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)鴨池鎮(zhèn)試驗地，每個株系4株。在苦蕎全生育期，根據(jù)M2代變異株的特點進行M3代株系突變性狀的重復觀測和鑒定，篩選記錄遺傳穩(wěn)定的突變體。對仍然產(chǎn)生分離的M3代株系，分單株收獲并對其M4代進行鑒定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007軟件計算平均數(shù)，采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變處理后Ml代性狀的變異

經(jīng)EMS處理后的2 000?？嗍w種子播種于試驗地，出苗793株，出苗率為39.65%。在其全生育期，發(fā)現(xiàn)植株長勢與對照差異較大（圖1B）。主要表現(xiàn)在79.82%植株明顯矮化、93.49%植株成熟期改變、6.90%的植株出現(xiàn)了部分葉片色澤、葉形異常，出現(xiàn)了1.92%小粒及2.30%不育及螞蟻危害死亡等變異植株。另外，發(fā)現(xiàn)M1代表型變異多數(shù)不能遺傳給M2代，最終得到的穩(wěn)定遺傳的突變體與所觀察到的M1代的某些變異性狀變化較大，可能是由于經(jīng)EMS誘變后，EMS對M1代種子有一定的傷害，導致M1代植株出現(xiàn)性狀的變化，這些變化多數(shù)不能遺傳，在M2代得到了恢復。

2.2 M2代突變體的篩選及農(nóng)藝性狀分析

以野生型苦蕎作為對照，對793份M2代按株系播種，每個株系4株，共3 172個單株，其中21株出現(xiàn)了突變，發(fā)生表型突變的頻率為0.66%。主要表現(xiàn)在株高、葉片、種子、育性、成熟期等性狀（表1）。

2.2.1 營養(yǎng)器官突變 在誘變?nèi)后w中共觀察到13株蕎麥的營養(yǎng)器官發(fā)生了突變，突變頻率為0.41%。葉色突變共6株，突變頻率為0.19%，包括整片葉片黃化突變（圖1C）、部分葉片黃化突變（圖1D）和葉片鑲嵌黃化突變（圖1E）。矮稈突變（圖1B）共5株，突變頻率為0.16%，株高在20～47 cm之間，平均株高僅為36.33 cm。葉片肥大突變（圖1F）共2株，突變頻率為0.06%，葉片明顯比正常植株葉片大且厚。

2.2.2 成熟期突變 在誘變?nèi)后w中共觀察到5株蕎麥的成熟期發(fā)生了突變，突變頻率為0.15%。包括早熟突變和晚熟突變。其中早熟突變共2株，突變頻率為0.06%，成熟期提前15 d。晚熟突變共3株，突變頻率為0.09%，成熟期推后20 d。

2.2.3 生殖器官突變 誘變?nèi)后w中共觀察到3株蕎麥的生殖器官發(fā)生了突變，突變頻率為0.09%。包括小粒突變和不育突變。其中小粒突變共2株（圖1G），突變頻率為0.06%，種子明顯比正常植株種子小。不育突變1株，突變頻率為0.03%，植株在苗期生長正常，可以開花，但花枯萎，無種子。

2.2.4 M2代突變體間及與對照間的總農(nóng)藝性狀分析 M2代突變體間及與對照間的株高、主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)、株粒數(shù)、株粒重和千粒重總農(nóng)藝性狀表現(xiàn)如表2所示。由表2可知，葉片肥大突變體總農(nóng)藝性狀值最高，為59.18，極顯著高于對照及其他突變體。對照的總農(nóng)藝性狀值為55.01，極顯著高于晚熟、小粒、矮稈和黃化突變體，顯著高于早熟突變體。早熟、晚熟和小粒突變體間差異不顯著，但均極顯著高于矮稈和黃化突變體，而矮稈和黃化突變體間差異不顯著。綜合以上分析發(fā)現(xiàn)，就總農(nóng)藝性狀表現(xiàn)而言，葉片肥大突變體表現(xiàn)值最大，而黃化突變體的表現(xiàn)值最小。在0.05水平上，其農(nóng)藝性狀綜合表現(xiàn)可將其排序為葉片肥大>對照>早熟、晚熟、小粒>矮稈、黃化。

2.2.5 M2代突變體間及與對照間的農(nóng)藝性狀分析 M2代突變體間及與對照間株高、主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)、株粒數(shù)、株粒重和千粒重的表現(xiàn)如表3所示。由表3可知，株高方面，葉片肥大、對照、早熟、晚熟、小粒和黃化突變體的株高差異不顯著，但均極顯著高于矮稈突變體。主莖分枝數(shù)方面，早熟、晚熟、小粒、葉片肥大突變體和對照間差異不顯著，但早熟、晚熟、小粒、葉片肥大突變體均顯著高于矮稈和黃化突變體，對照、矮稈和黃化突變體間差異不顯著，且早熟突變體與矮稈和黃化突變體，晚熟突變體與黃化突變體之間的差異達到極顯著水平。主莖節(jié)數(shù)方面，對照、晚熟、小粒、葉片肥大、早熟和矮稈突變體之間的差異不顯著，而對照和晚熟突變體均顯著高于黃化突變體，但未達到極顯著水平。株粒數(shù)方面，葉片肥大、小粒突變體和對照之間差異不顯著，但均顯著高于黃化突變體，而早熟、晚熟、矮稈和黃化突變體間差異不顯著。株粒重方面，葉片肥大、早熟、晚熟突變體和對照之間以及矮稈、小粒和黃化突變體之間差異均不顯著，但葉片肥大突變體極顯著高于矮稈、小粒和黃化突變體，對照顯著高于小粒和黃化突變體，另外早熟和晚熟突變體也顯著高于黃化突變體。千粒重方面，葉片肥大突變體和對照之間差異不顯著，顯著高于黃化和小粒突變體，極顯著高于小粒突變體。矮稈、早熟、晚熟和黃化突變體間差異不顯著，但均顯著高于小粒突變體，且矮稈、早熟、晚熟與小粒突變體間的差異達極顯著水平。

2.3 M3代突變體的表型鑒定

在M3代（部分M4代）再次對突變表型進行鑒定，有80.95%從M2代中篩選到的具有典型特征的突變體能夠穩(wěn)定遺傳而不再發(fā)生分離。通過對這些類型的突變體M2代和M3代（部分M4代）突變表型遺傳特點的觀察分析，在最終得到的突變體中，包括黃化、矮稈、小粒、早熟、晚熟、葉片肥大6種突變體類型。

3 小結(jié)與討論

突變體是某個性狀發(fā)生可遺傳變異或某個基因發(fā)生突變的材料，突變體的創(chuàng)制是進行植物功能基因組學和遺傳育種研究的重要途徑[1，24]。EMS誘變由于方法及條件簡單，誘變頻率高，染色體畸變相對較少，并能夠在短時間內(nèi)創(chuàng)制出大量突變體。因此其作為人工創(chuàng)造變異的一種手段越來越受到研究者的重視[25]。筆者首次利用化學誘變劑EMS對貴州地方栽培苦蕎進行處理，對其產(chǎn)生的突變體進行篩選和鑒定，創(chuàng)制了一些具有價值的突變體。在M2代獲得了黃化、矮稈、小粒、早熟、晚熟、葉片肥大6種類型的突變體，突變頻率為0.66%，其中黃化突變頻率最高，為0.19%，葉片肥大、早熟和小粒的突變頻率次之，均為0.06%，而不育突變頻率最小，僅為0.03%。進一步對M3代突變表型進行觀察，發(fā)現(xiàn)80.95%從M2代中篩選到的突變體能夠穩(wěn)定遺傳而未發(fā)生分離，最終得到黃化、矮稈、小粒、早熟、晚熟、葉片肥大6種類型的突變體。這6種類型突變體在株高、主莖節(jié)數(shù)、主莖分枝數(shù)、株粒數(shù)、株粒重和千粒重等農(nóng)藝性狀綜合表現(xiàn)方面，葉片肥大突變體的綜合表現(xiàn)值最大，對照次之，早熟、晚熟和小粒第三，而矮稈和黃化的最小。

在苦蕎育種過程中，對農(nóng)藝性狀的選擇十分重要，因為農(nóng)藝性狀的優(yōu)劣對苦蕎的高產(chǎn)性和穩(wěn)產(chǎn)性有重要的影響，但是不同農(nóng)藝性狀對苦蕎的產(chǎn)量影響不同。因此，本研究在對農(nóng)藝性狀進行綜合分析的基礎(chǔ)上，進一步對突變體間以及突變體與對照間的各農(nóng)藝性狀進行分析。結(jié)果表明，本研究所獲得的6種類型的突變體中，葉片肥大突變體、早熟突變體與對照間在株高、主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)、株粒數(shù)、株粒重和千粒重等農(nóng)藝性狀方面均無顯著差異。晚熟突變體除千粒重顯著低于葉片肥大突變體外，本研究中的其他農(nóng)藝性狀均與葉片肥大突變體、早熟突變體和對照間無顯著差異。矮稈突變體的株高顯著低于對照，其他農(nóng)藝性狀與對照間差異不顯著。小粒突變體株粒重和千粒重顯著低于對照，株高等其他農(nóng)藝性狀與對照無顯著差異。黃化突變體株高和主莖分枝數(shù)與對照間差異不顯著，主莖節(jié)數(shù)、株粒數(shù)、株粒重和千粒重均顯著低于對照。前人報道[26，27]發(fā)現(xiàn)，千粒重、單株粒數(shù)能有效地提高苦蕎的產(chǎn)量水平，千粒重對株粒重的直接效應(yīng)較大，是蕎麥品種選育的主要目標性狀和高產(chǎn)栽培的主攻方向。本研究中，葉片肥大突變體、早熟突變體與對照間的株粒數(shù)、千粒重和株粒重均無顯著差異。因此該兩種類型突變體在苦蕎產(chǎn)量選育上可能優(yōu)于其他突變體，而突變體之間以及突變體與對照之間的品質(zhì)性狀方面是否具有與農(nóng)藝性狀方面相同或相似的差異，有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 錢 前，程式華.水稻遺傳學和功能基因組學[M].北京：科學出版社，2006.

[2] 張曉勤，薛大偉，周偉輝，等.用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變的大麥浙農(nóng)大3號突變體的篩選和鑒定[J].浙江大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2011，37（2）：169-174.

[3] 郭建秋，雷全奎，楊小蘭，等.植物突變體庫的構(gòu)建及突變體檢測研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2010（6）：150-155.

[4] ALONSO J M，STEPANOVA A N，LEISSE T J，et al.Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana[J].Science，2003，301：653-657.

[5] JEON J S，JANG S，LEE S，et al.Leafy hull sterile is a homeotic mutation in a rice MADS box gene affecting rice flower development[J]. Plant Cell，2000，12：871-884

[6] 樊雙虎，郭文柱，路小鐸，等.玉米EMS突變體庫構(gòu)建及突變體初步鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014， 42（11）：3162-3165，3185.

[7] 張以忠，陳慶富.蕎麥研究的現(xiàn)狀與展望[J].種子，2004，23（3）：39-42.

[8] 姜 濤，孔令聰，王光宇，等.安徽省苦蕎麥種質(zhì)資源引種觀察及鑒定[J].農(nóng)學學報，2013，3（7）：8-10.

[9] 侯雅君，張宗文，吳 斌，等.苦蕎種質(zhì)資源AFLP標記遺傳多樣性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2009，42（12）：4166-4174.

[10] 李燕群，蒲 翔，李春梅，等.水稻507ys黃綠葉突變體的遺傳鑒定與候選基因分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2014，47（2）：221-229.

[11] 陳竹鋒，盧嘉威，盧啟清，等.優(yōu)質(zhì)水稻黃華占雄性不育突變體的篩選及初步分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2014，41（19）：1-4.

[12] 羅洪發(fā)，查仁明，楊洪海，等.水稻突變體的創(chuàng)制[J].中國農(nóng)學通報，2011，27（27）：45-49.

[13] 張紀元，張平平，姚金保，等.以EMS誘變創(chuàng)制軟質(zhì)小麥寧麥9號高分子量谷蛋白亞基突變體[J].作物學報，2014，40（9）：1579-1584.

[14] 杜麗芬，李明飛，劉錄祥，等.一個化學誘變的小麥斑點葉突變體的生理和遺傳分析[J].作物學報，2014，40（6）：1020-1026.

[15] ERMELINDA B，F(xiàn)RANCESCO S，ANTONIO H L，et al.High resolution melting analysis for the detection of EMS induced mutations in wheat SBEIIa genes[J]. BMC Plant Biol，2011，11：156.

[16] 劉祥久，劉曉麗.利用EMS誘發(fā)玉米性狀變異的效果[J].雜糧作物，2010，30（2）：88-90.

[17] 楊 鎮(zhèn)，劉曉麗，李 剛.EMS誘變劑對玉米自交系改造效果的研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學，2006（5）：7-10.

[18] 李國柱，董艷輝，申慧芳，等.苦蕎輻照突變體黃酮含量與PAL活性和農(nóng)藝性狀研究[J].激光生物學報，2010，19（4）：546-551.

[19] 田小麗.60Co-γ射線輻照誘發(fā)苦蕎突變體篩選高黃酮含量的種質(zhì)資源[J].科技情報開發(fā)與經(jīng)濟，2008，18（23）：150-152.

[20] YAO Y N，XUAN Z Y， HE Y M，et al. Principal component analysis of intraspecific responses of tartary buckwheat to UV-B radiation under field conditions[J]. Environ Exp Bot，2007，61（3）：237-245.

[21] SAMO K，？譒TRUKELJ B，GABER？譒IK A. Rutin in buckwheat herbs grown at different UV-B radiation levels： comparison of two UV spectrophotometric and an HPLC method[J]. J Exp Bot， 2002， 53： 1801-1804.

[22] BREZNIK B，GERM M， GABERSCIK A，et al.Combined effects of elevated UV-B radiation and the addition of selenium on common （Fagopyrum esculentum Moench） and tartary [Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn.] buckwheat[J]. Photosynthetica，2005，43（4）：583-589.

[23] 王安虎，戴紅燕，鄧建平.60Co-γ射線輻射苦蕎麥籽粒M2至M5代變異性狀不穩(wěn)定性研究[J].雜糧作物，2005，25（6）：364-366.

[24] MIYAO A，IWASAKI Y，KITANO H，et al.A large-scale collection of phenotypic data describing an insertional mutant population to facilitate functional analysis of rice genes[J]. Plant Molecular Biology，2007，63（5）：625-635.

[25] 羅洪發(fā)，查仁明，楊洪海，等.水稻突變體的創(chuàng)制[J].中國農(nóng)學通報，2011，27（27）：45-49.

[26] 楊明君，楊 嬡，郭忠賢，等.旱作苦蕎麥籽粒產(chǎn)量與主要性狀的相關(guān)分析[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2010，（2）：49-50.

[27] 楊玉霞，吳 衛(wèi)，鄭有良，等.苦蕎主要農(nóng)藝性狀與單株籽粒產(chǎn)量的相關(guān)和通徑分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（16）：6719-6721，6746.