王珊珊+徐海洋+王世明

摘要： 利用釀酒酵母高效的同源重組能力，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，將復(fù)制子pBBR1片段、KanR（卡納霉素抗性）片段、酵母復(fù)制子2 μ片段這3個(gè)兩端含有30 bp同源臂的片段電轉(zhuǎn)入釀酒酵母，通過同源重組獲得宿主更具廣譜性的革蘭氏陰性細(xì)菌-啤酒酵母穿梭質(zhì)粒pXZ200。經(jīng)檢測，pXZ200能夠在惡臭假單胞桿菌KT2440和大腸桿菌中穩(wěn)定復(fù)制。

關(guān)鍵詞： 釀酒酵母；同源重組；穿梭質(zhì)粒；PCR技術(shù)；pXZ200

中圖分類號(hào)： Q936 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0031-03

分子生物學(xué)中，利用DNA重組技術(shù)使宿主細(xì)胞獲得某種特殊能力是非常重要而且被廣泛利用的方法。然而，這種方法在體外需要經(jīng)多步的酶切和酶連，很大程度上依賴于載體上限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，步驟繁瑣，所連接片段一般限于幾個(gè)kbp大小，很少超過10 kbp，但同源重組的新方法克服了這種限制。

釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)有著較其他生物更高效的同源重組修復(fù)雙鏈DNA斷裂機(jī)制，是研究同源重組機(jī)制和應(yīng)用同源重組技術(shù)的主要模式生物 [1-2]。在釀酒酵母系統(tǒng)中，15 bp的同源序列就可以介導(dǎo)同源重組的發(fā)生，獲得重組克隆 [3]；當(dāng)兩端的同源序列為30 bp時(shí)，有效同源重組的頻率可接近80% [4-5]。PCR介導(dǎo)重組技術(shù)是指通過人工合成寡核苷酸單鏈作為PCR引物，用PCR擴(kuò)增方法得到重組片段的兩端帶有重組所需同源臂外源的DNA片段 [6-7]，是目前應(yīng)用最為廣泛的一種重組技術(shù) [4，8-10]，這種方法與傳統(tǒng)酶切酶連的基因克隆方法相比，具有很多優(yōu)點(diǎn)：省去了多步的酶切酶連，操作更為簡單快捷；不依賴于限制性酶切位點(diǎn)的存在，不會(huì)引入多余的堿基；通過合成特定的同源序列，目的基因可以精確地定位在靶位點(diǎn)上；解決了大片段的基因克隆問題 [11-12]。體外將合成的DNA片段利用釀酒酵母的重組機(jī)制，在體內(nèi)完成多個(gè)DNA片段的一步整合已被廣泛運(yùn)用。1970—2008年，DNA合成片段已經(jīng)從75 bp增加到583 kbp [13]。1970年，Khorana等成功合成丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的完整基因，這是第一次實(shí)現(xiàn)化學(xué)合成可遺傳序列 [14]；2008年，Venter研究組合成了由101個(gè)DNA片段構(gòu)建、長度為583 kbp的DNA [15]，該DNA通過體外合成25個(gè)具有同源臂的DNA片段，然后利用酵母重組機(jī)制合成基因組 [16]；2009年，Shao等在酵母中一步裝配完成含有8個(gè)基因的生化途徑，含有這個(gè)生化途徑的重組菌能夠利用木糖產(chǎn)生玉米黃質(zhì) [17]。

帶有完整2μ質(zhì)粒序列的質(zhì)粒pXZ198是一個(gè)既能在酵母中復(fù)制表達(dá)、又能在大腸桿菌中復(fù)制表達(dá)的穿梭質(zhì)粒，在研究中被廣泛應(yīng)用。但是，pXZ198質(zhì)粒只含有大腸桿菌的復(fù)制子Coli E1，而不能在其他原核細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)，而 pBBR1MCS5 卻是能夠在多種革蘭氏陰性菌中穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)的質(zhì)粒 [18]。本試驗(yàn)利用釀酒酵母的體內(nèi)高效重組系統(tǒng)，將廣譜復(fù)制子pBBR1、卡那霉素抗性基因KanR、酵母復(fù)制子2μ序列重組成一新的質(zhì)粒pXZ200，經(jīng)驗(yàn)證，該質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌及惡臭假單胞桿菌KT2440中穩(wěn)定復(fù)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、搖床、低溫離心機(jī)、冰箱、制冰機(jī)、無菌操作臺(tái)、滅菌鍋、電轉(zhuǎn)杯、電轉(zhuǎn)儀、多功能酶標(biāo)儀等。

1.1.2 主要試劑 DraⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA回收試劑盒、1 mol/L 山梨醇、氨芐抗生素、慶大霉素、卡那霉素、博來霉素等。

1.1.3 主要菌種和質(zhì)粒 釀酒酵母S288C、大腸桿菌DH5α、惡臭假單胞桿菌KT2440、含有完整2 μ序列及博來霉素抗性基因片段pXZ 的pXZ198質(zhì)粒、含有KanR片段的pET29a質(zhì)粒、含有在多種原核細(xì)胞中能復(fù)制的廣譜復(fù)制子pBBR1的pBBR1MCS5質(zhì)粒。

1.1.4 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基：2%蛋白胨、1%酵母粉、2%葡萄糖，pH值為7.0，115 ℃滅菌20 min。LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化鈉，pH值為7.0，121 ℃滅菌 15 min。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 打靶片段的準(zhǔn)備 在-80 ℃接種pXZ198 DH5α至含有100 μg/mL氨芐抗生素、接種pET29a DH5α至含有 50 μg/mL Kan、接種pBBR1MCS5 DH5α至含有30 μg/mL慶大霉素的LB試管中，37 ℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)；分別取約 3 mL 菌液，提取質(zhì)粒 [19]pXZ198、pET29a、pBBR1MCS5，用PCR擴(kuò)增方法獲得兩端含有30 bp同源臂的打靶片段，打靶片段PCR對(duì)應(yīng)的引物和模板見表1；每個(gè)片段擴(kuò)增約 120 μL，按照康寧生命科學(xué)的試劑盒回收各個(gè)片段；回收的各個(gè)片段進(jìn)行0.75%瓊脂糖電泳并測各片段的濃度。

1.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備 參照文獻(xiàn)[17]的方法制作酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)、KT2440電轉(zhuǎn)感受態(tài)以及采用大腸桿菌DH5α一步法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 [20]。

1.2.3 電轉(zhuǎn)重組及初步篩選 取50 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞置于預(yù)冷的0.2 cm的電轉(zhuǎn)杯中，加入打靶片段pXZ、pBBR1、KanR各5 μL，混勻；擦干電轉(zhuǎn)杯上的水，放入電轉(zhuǎn)化儀的樣品槽中，以1.5 kV進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；電轉(zhuǎn)結(jié)束，迅速將1 mL已滅菌的YPD培養(yǎng)基加入到電轉(zhuǎn)杯中；在無菌操作臺(tái)上，將電轉(zhuǎn)杯中液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL已滅菌的離心管中，30 ℃ 120 r/min復(fù)蘇1 h；取100 μL涂布于含有200 μg/mL博來霉素的YPD平板上，共涂10個(gè)平板；平板放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h。

1.2.4 酵母重組子的驗(yàn)證及pXZ200在酵母中的穩(wěn)定性 將平板上長出的單菌落隨機(jī)挑選出3個(gè)，并編號(hào)為1、2、3，接種至含200 μg/mL博來霉素的YPD試管中，30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h，以Kan-R、pBBR1-F為引物對(duì)重組子進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)PCR鑒定正確的重組子轉(zhuǎn)接至含有200 μg/mL博來霉素的50 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h以提取質(zhì)粒。由于酵母菌是真核生物，細(xì)胞的破碎難于大腸桿菌。試驗(yàn)采用液氮研磨的方法進(jìn)行細(xì)胞破碎，用酚氯仿反復(fù)抽提進(jìn)行質(zhì)粒的提取。質(zhì)粒以pXZR-F、pXZR-R為引物，送至上海桑尼生物科技有限公司測序，測序序列與pBBR1、KanR片段的序列進(jìn)行比對(duì)；測序正確的重組子轉(zhuǎn)接至YPD試管中，30 ℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)，反復(fù)轉(zhuǎn)接1周并提質(zhì)粒；對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行DraⅠ酶切，酶切體系為10 μL：pXZ200 3 μL、DraⅠ和10×M Bf各1 μL、無菌ddH2O 5 μL；0.75%瓊脂糖電泳檢測質(zhì)粒的正確性。

1.2.5 構(gòu)建質(zhì)粒在宿主細(xì)菌中的復(fù)制 將2 μL質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 [21]50 μL DH5α一步法感受態(tài)細(xì)胞中；轉(zhuǎn)化后加入600 μL的LB復(fù)蘇1 h；取100 μL涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，平板放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；挑取平板上長出的單菌落，接種到含有50 μg/mL卡那霉素的LB試管中，37 ℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；質(zhì)粒正確的菌轉(zhuǎn)接至LB試管中，37 ℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)，反復(fù)轉(zhuǎn)接1周并提取質(zhì)粒，對(duì)所提的質(zhì)粒進(jìn)行DraⅠ酶切；0.75%瓊脂糖電泳檢測質(zhì)粒的正確性。以同樣方法在假單胞桿菌KT2440中檢測pXZ200的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pXZ200質(zhì)粒的構(gòu)建

質(zhì)粒構(gòu)建的基本流程見圖1。

2.2 打靶片段的制備

由圖2可見，以PCR方式獲得兩端含有30 bp同源臂的打靶片段是正確的。經(jīng)測量，該片段濃度為100 ng/μL，適合作為打靶片段做電轉(zhuǎn)化。

2.3 對(duì)重組子的驗(yàn)證及 在酵母中的穩(wěn)定性。

結(jié)果表明，10個(gè)含200 μg/mL博來霉素的YPD平板上都長出單菌落，每個(gè)平板平均長出20個(gè)單菌落；對(duì)菌落進(jìn)行驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)，重組效率約為70%；對(duì)其中3個(gè)重組子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，由圖3可見，KanR和pBBR1 2個(gè)片段的長度大小約為2.5 kbp，1號(hào)和2號(hào)單菌落是正確的。將2號(hào)菌提出的質(zhì)粒以pXZR-F、pXZR-R為引物測序，經(jīng)與pBBR1及KanR片段的序列進(jìn)行比對(duì)，符合度達(dá)99%，證明該質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.4 構(gòu)建質(zhì)粒 在假單胞桿菌和大腸桿菌中的表達(dá)及穩(wěn)定性

從酵母菌提取的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入大腸桿菌和假單胞桿菌KT2440中，提質(zhì)粒（3 mL菌液）驗(yàn)證都正確（圖4）。將含有質(zhì)粒的大腸桿菌、假單胞桿菌KT2440及驗(yàn)證正確的酵母重組子分別連續(xù)轉(zhuǎn)接1周，所提取的質(zhì)粒經(jīng)DraⅠ酶切。由圖5可見，從大腸桿菌及假單胞桿菌KT2440中提取的質(zhì)粒和從酵母中提取的質(zhì)粒相比，大小一致且轉(zhuǎn)接1周后質(zhì)粒的量沒有變化，酶切后質(zhì)粒大小為5.3 kbp。說明 能夠在酵母菌、大腸桿菌DH5α和假單胞桿菌KT2440中穩(wěn)定復(fù)制。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建需要找到一個(gè)合適的載體，將目的片段和載體片段在相同的酶切后進(jìn)行酶連，再轉(zhuǎn)入到宿主菌中鑒定，如果構(gòu)建的質(zhì)粒需要插入多個(gè)片段，則工作量很大。本試驗(yàn)采用的方法比較簡單，只需要在PCR獲取目的片段時(shí)加入同源臂，然后將所有目的片段混勻，電轉(zhuǎn)到酵母感受態(tài)細(xì)胞中再進(jìn)行篩選驗(yàn)證。與傳統(tǒng)方法相比，這種方法對(duì)多片段質(zhì)粒的構(gòu)建簡單且易于操作。試驗(yàn)所構(gòu)建的新質(zhì)粒 能夠在酵母菌及大腸桿菌、假單胞桿菌中穩(wěn)定復(fù)制。

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