李 偉 胡紅梅 陳彩芬 黃玉珊 (井岡山大學臨床醫(yī)學院口腔系，江西 吉安 343000)

牙的缺失與損壞是常見疾病，目前治療措施有限，且都不能達到生理學的修復目的。2000年，Couble等〔1〕成功體外培養(yǎng)牙髓細胞，而且證實了牙髓中存在能夠分化成成牙本質(zhì)細胞的干細胞-牙髓干細胞，牙髓干細胞的發(fā)現(xiàn)將為牙體的再生研究提供新的思路。人表皮生長因子(HEGF)由53個氨基酸組成，是存在機體內(nèi)的一種細胞因子，是一種強有力的細胞分裂促進因子，有著廣泛的生理功能。有學者發(fā)現(xiàn)HEGF能促進大鼠牙髓干細胞的DNA合成和抑制大鼠牙髓干細胞的堿性磷酸酶的活性〔2〕。本研究利用基因工程技術(shù)克隆HEGF結(jié)構(gòu)基因，并進行構(gòu)建HEGF基因真核表達載體的研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料 pfu高溫DNA聚合酶(北京百川開泰公司)，Taq PCR Master Mix(上海生工)，限制性內(nèi)切酶 HindⅢ，BamHⅠ，dNTP ，T4 DNAligase Buffer，T4 DNAligase(Promega公司)，DH5α感受態(tài)細胞(上海生工)，克隆載體pcDNA3.1+，載體抗性 Ampicillin，載體長度 5.4 kb(上海生工)，geneRuler SM0331 marker(MBI公司)，引物設計:oiniga基因分析軟件，參照Pubmed上公布的HEGF基因序列進行分析后設計引物，引物由上海生工公司合成，

1.2 主要儀器 全溫度振蕩培養(yǎng)箱FZQ-F100(江蘇太倉華美儀器公司)，超低溫冰箱MDF-U53(日本三洋)，電熱恒溫鼓風干燥箱 SKFG-1(上海璽恒)，凝膠成像分析系統(tǒng) Bioseep Flexi1000(日本奧林巴斯)，紫外-可見分光光度計(北京普析通用)，酶標儀BIO-RAD(美國伯樂)，電子天平BSA-124S(德國SARTORIUS)，高壓滅菌鍋LX-B75-IL(北京華泰)，超凈工作臺SW-G-2FD(蘇州凈化)。

1.3 目的片段的擴增 參考Pubmed，HEGF的基因序列長度為183 bp，HEGF為8條引物，通過PCR擴增出足夠量的目的產(chǎn)物，PCR反應采用的是pfu高溫聚合酶。PCR各個成分的用量:(引物濃度為1 OD溶于400 μl ddH2O)，HEGF反應體系:50 μl，引物 Mix(0.4×引物條數(shù))3 μl，dNTP1 μl(25 mmol/L)，10× Pfu Buffer 5 μl，Pfu 0.4 μl(5 U/μl)，ddH2O 41 μl，引物 Mix為每條引物5 μl的混合液。PCR程序:95℃預變性3 min，94℃變性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，最后延伸 6 min，22 個反應循環(huán)。然后以PCR產(chǎn)物為模板，基因的首尾引物作為上下游引物，進行第二次擴增，PCR各個成分的用量:(引物濃度為1 OD 溶于 400 μl ddH2O)，反應體系:50 μl，第一輪 PCR 產(chǎn)物 2 μl，HEGF P1 2 μl，HEGF P8 2 μl，dNTP 1 μl(25 mmol/L)，10×Pfu Buffer 5 μl，Pfu 0.4 μl(5 U/μl)，ddH2O 38 μl。PCR 程序:95℃預變性 3 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸60 s，最后延伸6 min，22個反應循環(huán)。

1.4 PCR產(chǎn)物與載體pcDNA3.1+酶切回收 在HEGF基因PCR擴增以后，進行酶切回收實驗，首先在20 μl的PCR產(chǎn)物中加入其兩倍體積的Binding Buffer，然后轉(zhuǎn)入2 ml帶柱子的收集管中，13 000 r/min，離心，棄去收集管中濾液。加Binding Buffer 300 μl，13 000 r/min，離心，棄去收集管中濾液，此時DNA 已經(jīng)掛在柱子上。加 Wash Solution 700 μl，13 000 r/min，離心，棄去收集管中濾液。重復上述步驟，把DNA以外的雜質(zhì)洗脫完畢，將柱子裝入 1.5 μl的 EP 管中，加 50 μl，60℃的水洗脫 DNA，13 000 r/min，離心。酶切體系:50 μl，HEGF PCR 產(chǎn)物酶切體系:HEGF PCR 產(chǎn)物 20 μl，BamHI 1 μl(10 U/μl)，HindⅢ 1 μl(10 U/μl)，10×Buffer BamH Ⅰ 5 μl，ddH2O 23 μl，以上體系放入37℃恒溫水浴鍋中反應3 h。載體的酶切體系:pcDNA3.1+1.5 μg，BamHⅠ1 μl(10 U/μl)，HindⅢ 1 μl(10 U/μl)，10× Buffer BamHⅠ10 μl，ddH2O 補足至50 μl，以上體系放入37℃恒溫水浴鍋中反應3 h，將所需目的片段切膠回收備用。

1.5 目的片段與載體連接 酶切回收結(jié)束后，接下來將回收純化好的目的DNA片段和載體進行連接，連接體系:20 μl，酶切目的片段8 μl(50 ng)，酶切載體5 μl(100 ng)，10× T4，DNA-ligase Buffer 2 μl，T4 DNAligase 1 μl(5 U/μl)，ddH2O 補充至20 μl，上述連接混合液16℃水浴2 h即可。

1.6 轉(zhuǎn)化、篩選克隆 本次質(zhì)粒構(gòu)建實驗的關鍵步驟是要轉(zhuǎn)化，即將載體DNA導入感受態(tài)細菌中，從而得到含有目的DNA插入的轉(zhuǎn)化菌株，通過分析文獻及咨詢專家，最終選擇的感受態(tài)細菌是大腸桿菌株(DH5α)，取一試管感受態(tài)細菌DH5α置于冰上進行融化，溶化后取100 μl的菌液。將上述連接液轉(zhuǎn)入DH5α菌液中，輕輕搖動試管以便混勻混合物 HEGF，冰浴30 min，然后42℃中水浴90 s，冰浴3 min，此過程切勿搖動試管，向離心管中加入500 μl的LB液體培養(yǎng)基，混勻后37℃置于搖床上45 min，取已經(jīng)轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細菌DH5α置于LB固定培養(yǎng)基，檢測篩選出陽性克隆進行測序。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物純化結(jié)果按照Pubmed上的HEGF目的片段的相關信息，經(jīng)過兩輪PCR擴增出HEGF目的片段的基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.9%瓊脂糖凝膠電泳，純化，長度為183 bp。實驗所用的Marker是MBI公司的SM0331(圖1)，HEGF目的片段序列測序資料見圖2。

圖1 HEGF PCR產(chǎn)物純化(長度為183 bp)及MBI公司的SM0331 Marker

圖2 HEGF的基因序列測序圖譜

2.2 PCR產(chǎn)物與載體pcDNA3.1+酶切結(jié)果通過PCR產(chǎn)物與載體pcDNA3.1+酶切結(jié)果來看，PCR擴增出HEGF目的片段長度為183 bp，pcDNA3.1+酶切后的長度為5.4 bp，長度符合要求，酶切電泳圖見圖3，圖4。

圖3 HEGF酶切電泳圖

圖4 PCDNA3.1+酶切電泳圖

2.3 HEGF基因真核表達載體的構(gòu)建的酶切圖 重組質(zhì)粒pcDNA3.1+HEGF提取純化后的酶切圖譜顯示，pcDNA3.1的長度為5.4 bp，HEGF的長度為183 bp，已經(jīng)成功構(gòu)建了質(zhì)粒，見圖5。

圖5 成功構(gòu)建的pCDNA3.1+HEGF質(zhì)粒酶切圖

3 討論

牙齒是高度礦化的器官，是由于來源于外胚層的口腔上皮和底層的顱神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)細胞之間的相互作用的結(jié)果，牙再生醫(yī)學是利用生物技術(shù)完全再生出牙齒或牙齒局部組織再生，然而牙齒發(fā)育和萌出機制過于復雜，涉及牙髓干細胞、成牙本質(zhì)細胞、牙周膜細胞等多種細胞，尤其牙齒形成的關鍵細胞-牙髓干細胞的分化機制并不十分清楚因此，對牙髓干細胞等種子細胞進行基因修飾，促使其定向分化為牙齒組織甚至組織工程牙齒，就具有重要的意義。HEGF基因位于染色體4q25-27，mRNA約為4.75 kb，編碼含1 217個氨基酸前體，目前的研究發(fā)現(xiàn)其可促進組織的愈合并可使小鼠牙齒早萌，劉俊等〔3〕發(fā)現(xiàn)大鼠表皮生長因子可以促進體外培養(yǎng)的人牙髓干細胞的增殖，大鼠表皮生長因子有效作用濃度越大，牙髓干細胞生長密度越大。由于目前HEGF與真核表達HEGF及生物活性的差別，促使學者將HEGF基因?qū)胝婧吮磉_載體，采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其導入干細胞中，并獲得HEGF表達蛋白，使其持續(xù)分泌表達表皮生長因子，以促進干細胞的增殖和分化〔4〕。基因工程重組技術(shù)中能夠?qū)⒛康幕蜣D(zhuǎn)移至受體細胞的載體也影響著基因工程的研究進展，其中包括細菌質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒，pcDNA3.1+是一種真核表達載體，屬于構(gòu)建基因疫苗的載體，在哺乳動物表達載體能使重組質(zhì)粒獲得高水平表達的重組蛋白，能使外源基因在哺乳動物細胞中獲得瞬時或穩(wěn)定的表達，它帶有的Zeocin選擇標記比 G418經(jīng)濟快捷，增強子-啟動子序列為CMV，可獲得高水平的表達。目前用pcDNA3.1結(jié)合各種基因構(gòu)建質(zhì)粒影響神經(jīng)干細胞、骨髓基質(zhì)干細胞和軟骨細胞的研究都取得成功，對各種干細胞的增殖和分化都取得較好的作用〔5，6〕，但用pcDNA3.1來結(jié)合HEGF對牙髓干細胞的研究尚未見報道。

本次實驗為了牙髓干細胞的增殖和分化的后續(xù)研究，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-HEGF真核表達質(zhì)粒。并經(jīng)過測序分析，證實成功獲得pcDNA3.1+HEGF質(zhì)粒，本課題組將在隨后的研究中，對DPSC的增殖和分化進一步研究，為牙齒的再生研究奠定良好的實驗基礎。

1 Couble ML，F(xiàn)arges JC，Bleicher F，et al．Odontoblast differentiatlon of human dental pulp cells in explant cultures〔J〕．J Calcif Tissue Int，2000;66(2):129-38．

2 Liang RF.Effect of transforming growth factor-β epidermal growth factor on clonal rat pulp cells〔J〕．Arch Oral Biol，1990;35(1):7-11．

3 劉 俊，李玉晶，張海燕，等.表皮生長因子對人牙髓細胞DNA合成及細胞周期的影響〔J〕．現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志〔J〕．2003;17(3):200-2．

4 范青源，戴方平，應 康，等.人表皮生長因子基因體外轉(zhuǎn)染人角質(zhì)形成細胞的研究〔J〕．中華皮膚科雜志，2002;33(1):48-50．

5 徐 強，徐如祥，姜曉丹，等.重組質(zhì)粒pcDNA311his-hTH與pEGFPC2共轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細胞源神經(jīng)干細胞的實驗研究〔J〕．中華神經(jīng)外科，2005;21(2):118-22．

6 薛 震，呂松岑，趙金東，等.重組pcDNA3-1-hBMP-7真核表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細胞的實驗研究〔J〕．中國矯形外科，2007;15(20):1570-3．