吳宿慧 李 竹 李寒冰 李根林 (河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

衰老是多因素導(dǎo)致的身體功能的下降，同時伴隨著生化和生理功能的減弱，因此對外界環(huán)境、壓力、挑戰(zhàn)等反應(yīng)會有所降低，更易患上年齡相關(guān)的疾病而死亡〔1〕。自由基學(xué)說認(rèn)為體內(nèi)過多的自由基對大分子物質(zhì)的氧化損傷會加速衰老的進(jìn)程〔2〕。中醫(yī)養(yǎng)生理論認(rèn)為可以從食補、藥補以及采取自我調(diào)攝等為主的綜合措施以達(dá)到延緩衰老、延年益壽的目的。決明子為豆科植物決明或小決明的干燥成熟種子，是國家衛(wèi)生部公布的69種藥食同源品種之一，性味甘、苦、咸、微寒。歸肝、大腸經(jīng)。本草記載具有“輕身”作用，現(xiàn)代藥理研究具有清熱明目，潤腸通便、降血壓、降血脂之功效〔3，4〕。本研究在自由基學(xué)說的指導(dǎo)下，開展決明子體外抗氧化活性實驗，探討決明子水煎液對家蠶壽命的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 決明子購自鄭州市本草國藥館。經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院中藥資源鑒定教研室陳隨清教授鑒定為豆科植物決明的干燥成熟種子;維生素E由青島雙鯨藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字:H20043134，批號:001008)。

1.2 實驗動物 蠶(Bombyx mori L.)為昆蟲綱鱗翅目(Lepidoptera)蠶蛾科(Bombycidae)動物，品種:春雷·鎮(zhèn)珠，編號:20110610，由南陽市蠶種場提供。

1.3 試劑與儀器 DPPH·(美國 Sigma公司，批號:STBC5116V);超氧化物歧化酶(SOD)(批號:20121105)、丙二醛(MDA)(批號:20121108)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(批號:20121101)，胰脂肪酶(批號:20121112)，脂聯(lián)素(批號:20121115)，均購自南京建成生物工程研究所。BIORAD-680酶標(biāo)儀，680Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories);DZKW-4電子水浴鍋(上海東星建材試驗設(shè)備有限公司);BS-210S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);SZ-093雙重蒸餾器(上海市亞榮生化儀器廠);TDL-40B型低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.4 體外抗氧化實驗

1.4.1 溶液制備 ①DPPH·溶液的制備:精密稱取40 mg DPPH·，溶解于480 ml無水乙醇，用500 ml量瓶定容。濃度即為20 mmol/ml，避光保存(0～4℃)備用。②陽性對照品維生素E溶液的配制:取維生素E膠丸一粒(100 mg)，剪破膠丸殼，加入5 ml無水乙醇溶解，濃度即為20 g/L。③決明子供試溶液的制備:取20.00 g決明子，研碎成細(xì)末，放入棕色瓶，室溫下密封保存;取樣品粉末4.00 g，入100 ml燒杯中，加20 ml雙蒸水封口超聲提取20 min，抽濾棄濾渣，定容至20 ml，得0.2 g/ml的決明子水溶液;同法制得0.2 g/ml決明子無水醇溶液，封口避光低溫(0～4℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 加樣與檢測 將制備好的決明子不同溶媒的溶液作為母液按0.5倍梯度稀釋法，配制7個濃度遞減的梯度溶液進(jìn)行抗氧化活性測定。

1.5 動物實驗

1.5.1 藥品制備 決明子高劑量組:精確稱取決明子65.0 g，常溫下加8倍雙蒸水浸泡1 h，電磁爐上煎煮0.5 h，再加6倍雙蒸水繼續(xù)煎煮0.5 h，抽濾棄渣，用雙蒸水定容藥液至100 ml，制得藥液濃度為0.65 g/ml。決明子中劑量組:精密稱取決明子35.0 g，按上述方法制得藥液濃度為0.35 g/ml。決明子低劑量組:精密稱取15.0 g，按上述方法制得藥液濃度為0.15 g/ml。維生素E溶液:取維生素E成藥制成0.15%的溶液(每100 ml藥液含0.15 g維生素E)，放置冰箱中(0～4℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 實驗分組及飼養(yǎng) 取齡期相同生長整齊的三眠蠶隨機分為五組，即空白對照組，決明子水煎液高、中、低劑量組，維生素E組，每組85條。按飼養(yǎng)常規(guī)置于同一溫度、濕度環(huán)境下飼養(yǎng)。每天喂桑葉3次，并記錄食桑量，在4齡期第2天、第3天、第4天每天喂涂藥桑葉1次，5齡期第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天每天喂涂藥桑葉1次，共給藥9次。涂藥時，按每100 g桑葉20 ml的比例涂抹在新鮮桑葉上(空白對照組噴灑雙蒸水)，晾干后當(dāng)天第1次喂食，給藥時各組桑葉量為正常食桑量的50%(以消除給藥對各組家蠶食桑量的影響)。待其進(jìn)食完藥桑后再添加正常食量桑葉。定期稱量家蠶體重，監(jiān)測生長狀況。

1.5.3 指標(biāo)測定 觀察全生存期(卵孵化成幼蟲至蠶蛾死亡的時間)，包括幼蟲期(卵孵化至結(jié)繭完成的時間)、蛹期(結(jié)繭后至蛹羽化的時間)、蛾期(未交尾，為羽化至死亡的時間)。

取5只家蠶，在五齡期第3天采集血淋巴，在蟲體第二腹節(jié)處用針扎破體壁取血淋巴液，為防止血淋巴氧化變黑，在采樣容器中加入少量苯基硫脲。為盡量不破壞酶活性，使血樣保持在冰浴中。4000 r/min離心取上清，測血淋巴中SOD、GSHPx酶活力及MDA含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用Turkey HSD方法進(jìn)行分析，相關(guān)性子樣采用Pearson相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 不同溶媒?jīng)Q明子溶液體外抗氧化活性的比較 決明子水溶液、醇溶液和維生素E溶液的線性考察結(jié)果顯示三者的線性都較好〔決明子水溶液:y=11.801Ln(x)+61.236，R2=0.9828;決明子醇溶液:y=11.809Ln(x)+41.804，R2=0.863;維生素 E:y= －43.824Ln(x)+105.99，R2=0.9641〕，經(jīng)過對自由基清除率量-效曲線進(jìn)行作圖發(fā)現(xiàn):不同溶媒?jīng)Q明子溶液和維生素E對自由基清除率與對數(shù)劑量之間呈良好的相關(guān)性，表明:三者的抗氧化作用趨勢在一定范圍內(nèi)隨劑量增加而增加。決明子水溶液、醇溶液和維生素E溶液的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.177，0.927，0.161 g/L，表明抗氧化活性依次是:維生素E＞決明子水溶液＞決明子醇溶液。見圖1。

圖1 決明子水溶液、醇溶液、維生素E抗氧化活性量效曲線

2.2 決明子不同濃度水煎液對家蠶各生長階段生長時間的影響 不同生藥濃度決明子處理對家蠶幼蟲期(F4，399=405.907，P ＜0.001)、蛹期(F4，399=1336.631，P ＜0.001)、蛾期(F4，399=1586.336，P ＜ 0.001)、全生存期(F4，399=1146.096，P ＜0.001)的影響均有極顯著性的統(tǒng)計學(xué)意義。與空白組比較，各處理組對家蠶幼蟲期的影響均達(dá)到了極顯著性的差異水平(P＜0.001);與維生素E對照藥組相比，高劑量組無差異(P=0.999);而中劑量組與低劑量組有極顯著性差異(P＜0.001);家蠶蛹期的處理結(jié)果表明:與空白對照組相比，各處理組的影響均有極顯著性差異(P＜0.001);與維生素E對照組相比，高劑量組(P=0.814)和中劑量組(P=0.195)無差異，低劑量組(P=0.035)有顯著差異;家蠶蛾期的處理結(jié)果表明:與空白對照組相比，各處理組的影響均有顯著差異(P＜0.05)，其中，低劑量組達(dá)到了極顯著的差異水平;與維生素E對照藥組相比，各給藥組均無明顯差異;為了明確不同處理對家蠶壽命的影響，把幼蟲期、蛹期、蛾期的數(shù)據(jù)進(jìn)行相加得到家蠶全生長期，結(jié)果表明:與空白對照組相比，各處理組數(shù)據(jù)均有極顯著增加(P＜0.001);且隨著給藥劑量增大，家蠶全生長期天數(shù)有一定升高，呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。與維生素E對照組相比，高劑量組(P=0.987)和中劑量組(P=0.092)無差異，低劑量組有顯著差異(P=0.004);見表1。為了確定決明子不同濃度水煎液對家蠶各生長階段的效應(yīng)，用各處理組數(shù)據(jù)與該生長階段空白對照組相減后再和空白對照組相比得到各生長期的延長率，見表1。

表1 不同濃度決明子水煎液對家蠶各生長階段的影響(±s，n=80)

表1 不同濃度決明子水煎液對家蠶各生長階段的影響(±s，n=80)

與空白對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與維生素E組比較:3)P＜0.01;下表同

組別 幼蟲期生存期(d) 延長率(%)蛹期生存期(d) 延長率(%)蛾期生存期(d) 延長率(%)全生長期生存期(d) 延長率(%)空白對照組 26.57±0.07 － 11.15±0.02 － 5.28±0.03 － 43.00±014.64.08 －決明子低劑量組 28.96±0.022)3) 8.9611.96±0.032) 7.225.99±0.042) 13.4246.90±0.062)3) 9.06決明子中劑量組 29.90±0.042)3) 12.5012.10±0.072) 8.536.30±0.051) 19.2448.30±0.102) 12.31決明子高劑量組 31.04±0.032) 16.8012.20±0.042) 9.406.31±0.031) 19.2549.55±0.092) 15.22維生素E組 30.41±0.032) 14.4412.38±1.122) 11.056.50±0.071) 23.1449.30±1.582)

2.3 決明子水煎液對家蠶血淋巴中GSH-Px、SOD、MDA的影響 不同生藥濃度決明子處理對家蠶血淋巴中GSH-Px(F4，24=25.430，P ＜0.001)、SOD(F4，24=48.963，P ＜0.001)、MDA(F4，24=52.701，P＜0.001)的影響均有極顯著性的差異。與空白對照組相比，GSH-Px活力隨著決明子水煎液濃度增大而增大，在決明子中劑量組(P=0.001)，決明子高劑量組(P＜0.001)，均具有極顯著差異;SOD活力與GSH-Px活力變化趨勢相同，隨著決明子水煎液濃度增大而增大，且在各濃度組中均有顯著地增加(P＜0.001)。MDA水平在決低組有顯著增加(P=0.044)，在決高組有顯著降低(P＜0.001)。與陽性對照藥維生素E組相比，決高組GSH-Px活力的增加顯著高于維生素E(P=0.001)，達(dá)到極顯著的差異水平;不同濃度組SOD活力的增加與維生素E組無顯著差異(P＞0.005);MDA水平在各濃度組均有顯著性的降低(P＜0.001)。見表2。

2.4 家蠶血淋巴中GSH-Px、SOD、MDA與壽命的相關(guān)性 血清中GSH-Px濃度與全生長期之間呈正相關(guān)(r=0.759，P=0.13)，但沒有達(dá)到顯著差異(P=0.130);血清中SOD活力與全生長期之間有極顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.971，P=0.006)，血清中MDA濃度與全生長期之間有負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=－0.481)，依然沒有顯著性(P=0.421)。

表2 決明子水煎液對家蠶體內(nèi)GSH-Px、SOD、MDA的影響(±s，n=5)

表2 決明子水煎液對家蠶體內(nèi)GSH-Px、SOD、MDA的影響(±s，n=5)

組別 GSH-Px(U/L) SOD(U/L) MDA(nmol/L)6.62±2.4174.86±5.007.12±0.94維生素E組 28.62±4.741)97.74±1.302) 1.83±0.402)決明子低劑量組 13.77±1.9092.84±2.892)8.93±0.431)3)決明子中劑量組 41.62±18.572)95.46±3.052) 8.64±1.263)決明子高劑量組 70.62±15.982)3)96.12±0.982)4.27±1.262)3)空白對照組

3 討論

本結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)，決明子無水醇溶液的抗氧化活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于維生素E和決明子水溶液，這可能和不同溶媒中所含的決明子有效成分不同有關(guān)，但維生素E和決明子水溶液清除DPPH·能力相當(dāng)，與前期研究結(jié)果一致〔5〕。研究表明經(jīng)不同濃度的乙醇提取時，主要為決明子中的有效成分中脂溶性物質(zhì)蒽醌類，而水提物中，主要為水溶性的蒽醌甙類物質(zhì)〔6〕。徐建國等〔7〕采用超氧陰離子自由基體系、羥基自由基體系及DPPH·體系對決明子水提物的清除自由基活性進(jìn)行了研究并比較得知:決明子水提物對超氧陰離子自由基、經(jīng)氧自由基和過氧化氫自由基均有較好的清除作用，且清除能力較強，與維生素E相當(dāng)。該結(jié)果與本研究一并體現(xiàn)出決明子在體外的抗氧化能力。已有研究表明，決明子水煎劑對多種營養(yǎng)性疾病有抑制作用〔8〕，而這種作用的發(fā)揮可能與其體內(nèi)抗氧化活性有關(guān)。在抗衰老的研究中，家蠶以生命周期短，觀察方便，易于重復(fù)等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用〔9～13〕。本研究結(jié)果表明，決明子高、中、低劑量組與陽性對照藥維生素E組對家蠶各生長期均有明顯延長作用。隨著決明子水煎液給藥劑量加大，延長率更加明顯，且給藥劑量與全生長期之間有明顯量效關(guān)系。這與火麻仁油、火麻仁甾醇、芝麻油處理致家蠶壽命增加效果一致，但決明子水煎液效果明顯優(yōu)于火麻仁油、芝麻油，劣于火麻仁甾醇〔9，11，13〕。本草記載決明子具有“輕身”作用，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載“不饑輕身延年”，表明輕身與抗衰老的關(guān)系〔14〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明中藥有效成分可與體內(nèi)自由基結(jié)合，抑制過氧化反應(yīng)，降低脂褐素和增齡色素的沉積，延緩衰老〔15〕。本實驗通過收集家蠶血淋巴檢測與自由基學(xué)說相聯(lián)系的指標(biāo)，MDA是膜脂過氧化終產(chǎn)物，衰老時，活性氧積累誘發(fā)膜脂過氧化加快，MDA增多。SOD作為生物體內(nèi)的“垃圾清道夫”，可清除機體內(nèi)的超氧陰離子自由基。GSH-PX作為機體中重要的過氧化物分解酶，對保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受過氧化物的干擾和損害〔16〕。本實驗結(jié)果顯示，決明子水煎液中有效成分與家蠶體內(nèi)自由基結(jié)合，可能會減少機體的氧化損傷，延緩衰老。推測這一結(jié)果與決明子的功效息息相關(guān)，決明子具有的潤腸通便之功效可以排出隨年齡增長而在體內(nèi)積累的毒素，另外，決明子的抗氧化作用可清除糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的自由基，使機體氧化應(yīng)激能力增強，改善衰老狀態(tài)。本研究結(jié)果為探究決明子的藥理作用機制提供了理論和實驗依據(jù)，也為指導(dǎo)其臨床合理應(yīng)用提供了強有力的證據(jù)。

1 Hsin-Chen Lee，Yau-Huei Wei.Role of mitochondria in human aging〔J〕.J Biomed Sci，1997;4(6):319-26.

2 Harman D.The aging process〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1981;78(11):7124-8.

3 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典〔S〕.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:135.

4 董曉強，尹占芳.決明子的化學(xué)成分及藥理作用研究〔J〕.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2013;20(7):18-9.

5 吳宿慧，馬永潔，蔣 娜，等.決明子抗衰老系列實驗Ⅰ:決明子體外抗氧化與抑制胰脂肪酶活性研究〔J〕.中國醫(yī)藥指南，2013;11(34):342-4.

6 陸賽衛(wèi)，袁 華.正交試驗法優(yōu)選決明子的提取工藝〔J〕.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校學(xué)報，2010;32(2):105-8.

7 徐建國，胡青平.決明子水提物體外清除自由基活性的研究〔J〕.食品科學(xué)，2006;27(6):73-6.

8 任愛紅，閆君寶，胡詠梅，等.決明子對營養(yǎng)性肥胖大鼠的影響〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005;26(16):1490-2.

9 李寒冰，孫靜雅，馬永潔，等.火麻仁油及甾醇對家蠶壽命影響的觀察〔J〕.中醫(yī)學(xué)報，2012;27(9):1145-7.

10 李獻(xiàn)平，劉世昌.四大懷藥對家蠶壽命及生長發(fā)育的影響〔J〕.中國中藥雜志，1990;15(9):51-3.

11 任漢陽，李寒冰，張 瑜，等.火麻仁油對家蠶壽命影響的實驗研究〔J〕.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007;2(2):79-81.

12 任漢陽，王玉英，張 瑜，等.黃精粗多糖對家蠶壽命的影響〔J〕.山東中醫(yī)雜志，2006;25(3):200-2.

13 王宏賢.芝麻油對家蠶壽命影響的實驗研究〔J〕.中原醫(yī)刊，2008;35(8):15-6.

14 朱 平.“輕身”藥辨析〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2013;28(3):605-8.

15 賴學(xué)鴻.決明子茶和運動雙重干預(yù)對老年女性的減肥效果〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(13):2402-4.

16 葉 剛，楊 銳，楊懷銘.云安紅景天對衰老模型大鼠的抗衰老作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014;34(14):3960-2.