王浩華，謝美華，2，宋信信

(1.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000;2.云南省高校應(yīng)用生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 楚雄 675000)

粗網(wǎng)柄牛肝菌 (Boletus ornatipes Peck)屬傘菌目、牛肝菌科、牛肝菌屬，是一類外生菌根菌，夏秋季生于闊葉林中地上，群生或單生，廣東、四川、江蘇、安徽、云南等地都有分布［1］。食用菌多糖發(fā)展前景廣闊，具有重大的開發(fā)利用價(jià)值，新型藥物越來越多地應(yīng)用于臨床，綠色、天然、安全、高效的食用菌多糖必將成為探索和發(fā)掘功能性食品和新型藥物制劑的重要領(lǐng)域之一［2—5］。牛肝菌作為肉質(zhì)大型真菌目前開發(fā)廣泛，粗網(wǎng)柄牛肝菌作為其中的組成成員具有很好的開發(fā)潛力。提取多糖的方法有微波、熱水浸提、超聲波超臨界流體萃取，酶解法和酸堿法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前，對粗網(wǎng)柄牛肝菌多糖的提取方法還未見報(bào)道，本文采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選粗網(wǎng)柄牛肝菌多糖提取工藝，旨在為其的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

采集云南省楚雄市闊葉林中的野生粗網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體，用蒸餾水沖洗干凈，切成片狀放入白色瓷盤中，105℃烘干30min后90℃恒重24h之后取出研磨成粉狀過40目篩。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［6］

所得線性回歸方程為y=0.0148x－0.0002，R2=0.9994。說明線性良好。

1.2.2 粗網(wǎng)柄牛肝菌真菌多糖的提取單因素試驗(yàn)

用電子天平準(zhǔn)確稱取三份0.5g粗網(wǎng)柄牛肝菌的子實(shí)體粉末放入三個(gè)燒杯中，編號(hào)A，B，C.往三個(gè)燒杯中加水30ml。將A放入微波爐中微波5min，B用熱水浸提放提取2小時(shí)，C用超聲波法20min。之后分別過濾，取濾液，加入活性炭除去色素，抽濾后取濾液用sevage法除蛋白質(zhì)，進(jìn)行離心，離心后取上層清液即為粗網(wǎng)柄牛肝菌粗多糖液。吸取A，B，C中的真菌多糖溶液用苯酚－硫酸比色法在490nm下測定其吸光度。

1.2.3 正交試驗(yàn)

通過單因素的試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn) (表1)。

表1 因素與水平TableTable 1.factors and levels

1.2.4 最佳提取條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證結(jié)果的穩(wěn)定性，每組稱取原料粉0.5g，每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)進(jìn)行多糖的提取。

1.2.5 粗網(wǎng)柄牛肝菌多糖抗氧化能力的研究，DPPH法［7—8］。

2.結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，微波法提取的效果最好，與熱水浸提法相比在5%水平顯著差異，與超聲波提取法相比在1%水平差異極顯著 (表2)。

表2 單因素提取粗網(wǎng)柄牛肝菌多糖的結(jié)果Table 3 Result of Single factor methods on polysaccharides of Boletus ornatipes

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 從試驗(yàn)結(jié)果得出，最佳提取方法是微波加熱6min、1∶60的料液比、提取3次。極差分析結(jié)果表明，對粗網(wǎng)柄牛肝菌多糖得率的影響依次為料液比、微波時(shí)間、提取次數(shù) (表3)。對粗網(wǎng)柄牛肝菌多糖得率有極顯著影響的是不同的微波時(shí)間和料液比，不同提取次數(shù)對多糖得率影響不顯著(表4)。

表3 粗網(wǎng)柄牛肝菌提取菌多糖正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal tests of Boletus ornatipes

表4 粗網(wǎng)柄牛肝菌提取菌粗多糖正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 The table of variance analysis of Boletus ornatipes，polysaccharides

2.2.2 最佳提取條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

驗(yàn)證試驗(yàn)粗多糖得率平均為32.62±0.67(mg/g)，說明試驗(yàn)工藝穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。

2.3 粗網(wǎng)柄牛肝菌粗多糖抗氧化能力的檢測

粗網(wǎng)柄牛肝菌粗多糖質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時(shí)的抑制率為96.06%，說明粗網(wǎng)柄牛肝菌粗多糖存在較強(qiáng)的抗氧化活性 (表5)。

表5 粗網(wǎng)柄牛肝菌粗多糖與Vc抗氧化抑制率比較Table 5 Antioxidant inhibitory rate of Boletus ornatipes，polysaccharides compared with Vc

3.討論與結(jié)論

3.1 就三種提取方法來說微波法優(yōu)于其他兩種方法在料液比相同的情況下，微波提取方法的多糖得率是熱水浸提法的1.12倍，是超聲波法的1.4倍。這可能得益于高頻率的電磁波能夠較好的穿透入物體的深處，從而導(dǎo)致細(xì)胞破裂，胞內(nèi)有效成分流出，從而容易進(jìn)入提取溶劑。

3.2 選擇微波法作正交試驗(yàn)，從正交試驗(yàn)結(jié)果得出最佳提取工藝為微波時(shí)間6min、料液比1∶60，提取次數(shù)3次，多糖得率高達(dá)31.93mg/g。從表6知道料液比和微波時(shí)間 (0.01＜P＜0.5)對粗網(wǎng)柄牛肝菌多糖的提取有極顯著的影響，而提取次數(shù) (P＜0.01)對其沒有顯著地影響，這是因?yàn)榈谝淮翁崛【鸵呀?jīng)提取出大部分多糖，再多提取幾次也只是獲得了相當(dāng)少的多糖，這一點(diǎn)對以后大規(guī)模工廠化生產(chǎn)多糖具有重要的參考價(jià)值，工廠可以參考這一點(diǎn)從而在最少提取次數(shù)，花費(fèi)最少的人力、物力下獲得最大多糖得率。而料液比和微波時(shí)間對獲得多糖有顯著的影響，所以要獲得更高的多糖得率可以從料液比和微波時(shí)間選擇上下功夫，探索出能獲得最大多糖得率的最佳方法。

3.3 羥基自由基反應(yīng)性極強(qiáng)，對機(jī)體的破壞作用最大，可以導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生和機(jī)體的衰老，用云南野生菌粗網(wǎng)柄牛肝菌粗多糖進(jìn)行抗氧化性試驗(yàn)得出，其粗多糖有抗氧化的能力，且在一定濃度范圍內(nèi)，粗網(wǎng)柄牛肝菌抗氧化的能力隨著不同的濃度升高，其菌多糖抗氧化的能力是其藥用價(jià)值的基礎(chǔ)?？梢钥紤]將粗網(wǎng)柄牛肝菌作為抗氧化劑應(yīng)用于食品和保健食品。

3.4 測定多糖含量是根據(jù)在其生成物的最大吸收峰的吸光度值來定量測定的，野生菌所含色素會(huì)影響測定值的大小。多糖測定過程中，不同的脫色方法對多糖的測定的含量影響很大，陶美華的研究表明，過氧化氫的脫色效果比活性炭好，但是過氧化氫脫色會(huì)使多糖嚴(yán)重?fù)p失，這是得不償失的。［8］所以本實(shí)驗(yàn)選活性炭作為脫色劑是科學(xué)的。

［1］張春霞，紀(jì)開萍，何明霞，等.暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體營養(yǎng)成分分析［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，6:702—704.

［2］Wu F，Yan H，Ma X，et al.Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris［J］.J Microbiol Res，2011，5(18):2743—2751.

［3］Umehara S，F(xiàn)ujiwara H，Shiozaki A，et al.PSK induces apoptosis through the inhibition of activated STAT3 in human esophageal carcinoma cells［J］.Int Joncol，2012，4l(1):61—6.

［4］Xiao JH，Xiao DM，Chen DX，et al.Polysaccharides from the medicinal mushroom Cordyceps taii show antioxidant and immuno enhancing activities in a Dgalactose－induced aging mouse model［J］.Evid Based Complement Alternal Med，2012:2734—2735.

［5］Li XT，Zhang YK，Kuang HX，et al.Mitochondrial protection and anti－ aging activity of Astragalus polysaccharides and their potential mechanism ［J］.Int J Mol Sci，2012，13(2):1747—1761.

［6］謝美華，羅中澤，李霖，等.云南野生紫紅牛肝菌粗多糖提取方法及活性測定［J］.食品科技，2014，39(6):199—203.

［7］李麗，劉質(zhì)凈，時(shí)東方，等.車前草中苯乙醇苷類化合物的抗氧化活性研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(1):275—277.

［8］陶美華，潘清靈，章衛(wèi)民.藥用真菌多糖含量測定方法研究［J］.中國食用菌，2005，24(5):37—38.