張明嬌， 吳 勇， 李珉珉

(暨南大學附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學檢驗中心，廣東廣州510632)

在組成人類的約30億個堿基對中，蛋白編碼序列只占1.5%，而其余不編碼蛋白質(zhì)的序列曾一度被認為是基因組進化過程中的“垃圾序列”。2013年發(fā)布的ENCODE研究數(shù)據(jù)表明，所謂的“垃圾序列”絕大多數(shù)被轉(zhuǎn)錄成分子長度超過200個核苷酸的長鏈非編碼 RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)。隨著高通量檢測技術(shù)的發(fā)展，lncRNAs的面紗逐漸被揭開，并根據(jù)其與編碼基因的位置關(guān)系可分為正義、反義、基因間等6類［1］。lncRNAs由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，不具有或少有開放閱讀架 (open reading frame，ORF)，在多種層面調(diào)控包括細胞分化和個體發(fā)育在內(nèi)等的重要生命進程，其異常表達還與多種人類重大疾病密切相關(guān)。本文結(jié)合國內(nèi)外lncRNAs的研究現(xiàn)狀，對其生物學功能，包括對基因表達的調(diào)控功能、在細胞分化和個體發(fā)育中的作用及其與常見惡性腫瘤的關(guān)系進行綜述。

1 lncRNAs的自身表達調(diào)控

目前認為lncRNAs主要來源于下列途徑:蛋白編碼基因在多種因素下斷裂形成lncRNAs;非編碼基因通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生沒有功能的非編碼反轉(zhuǎn)錄假基因lncRNAs;染色質(zhì)發(fā)生重排后過程中，2個不轉(zhuǎn)錄且相隔較遠的序列合并產(chǎn)生lncRNAs;小非編碼RNA中的某段序列多次復制形成;轉(zhuǎn)錄因子中插入一段序列形成［2］。LncRNAs具有廣泛的組織和細胞表達譜，越來越多的證據(jù)顯示，在真核細胞內(nèi)lncRNAs被普遍轉(zhuǎn)錄，但不具有或很少具有蛋白編碼功能。lncRNAs與蛋白編碼基因相比具有更強的組織和細胞表達特異性，如它們在小鼠胚胎干細胞分化過程中特異表達，而在小鼠大腦中具有亞細胞精確定位功能［3］。LncRNAs還具有不同的表達模式，對大量組織和細胞都有調(diào)節(jié)作用，并且在一些疾病中其表達水平會發(fā)生變化，這涉及到許多重要的生物學過程。

2 lncRNAs調(diào)控基因表達的多種作用形式

2.1 lncRNAs的表觀遺傳學的調(diào)控 Xist RNA是最早被發(fā)現(xiàn)調(diào)控X染色體失活的lncRNAs，主要機制為Xist RNA與即將沉默的染色體區(qū)域結(jié)合形成“沉默區(qū)間”，以此招募多梳蛋白抑制物復合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)，通過抑制組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(histone H3 lysine 27 trimethylation，H3K27me3)的刺激因素導致X染色體沉默，從而調(diào)控細胞的增殖和分化。近年有研究發(fā)現(xiàn)［4］，Xist基因可作為唐氏綜合癥的治療靶點，這一發(fā)現(xiàn)預示著lncRNAs可用于疾病治療尤其是在再生醫(yī)學領(lǐng)域。此外，由HOX基因轉(zhuǎn)錄本的反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)同樣能夠招募PRC2并將其定位到HOXD位點，進而誘導HOXD位點的表觀遺傳沉默［5］。

2.2 lncRNAs的順式調(diào)控作用 由蛋白編碼基因增強子區(qū)轉(zhuǎn)錄的lncRNAs稱e-RNAs，這類lncRNAs具有類似增強子的功能，通過招募轉(zhuǎn)錄激活因子與其形成復合體，增強鄰近靶基因的表達。由HOXA基因家族轉(zhuǎn)錄的Hottip lncRNA可進入HOXA基因簇形成的染色質(zhì)環(huán)內(nèi)，與MLL-WDR5復合體結(jié)合使其到達HOXA基因，刺激該區(qū)組蛋白H3第4位賴氨酸三甲基化(histone H3 lysine4 trimethylation，H3K4me3)，進而促進HOXA下游基因的轉(zhuǎn)錄［6］。作為bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員neurogenin 1，其表達依賴于 utNgn1 e-RNA的表達，而utNgn1 e-RNA編碼neurogenin 1基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游7 kb的區(qū)域。多梳家族蛋白(polycomb group proteins，PcG)可以抑制utNgn1 e-RNA及neurogenin 1的表達，并且敲低utNgn1后可直接導致neurogenin 1的表達量減少［7］，這一現(xiàn)象提示neurogenin 1的表達受utNgn1 e-RNA表達水平的順式調(diào)控。

2.3 lncRNAs的反式調(diào)控作用 B2 lncRNA通過與RNA聚合酶Ⅱ羧基末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain，CTD)結(jié)合，通過阻止其磷酸化來抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性，從而影響整體轉(zhuǎn)錄水平。研究表明B2 lncRNA受到壓力信號刺激時表達上調(diào)，阻止一切轉(zhuǎn)錄活動，提示這可能是作為細胞保護的一種機制［8］。類固醇受體激活物(steroid receptor activator，SRA)是在RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達2個水平上發(fā)揮功能的分子。SRA基因編碼的lncRNA主要參與核受體的轉(zhuǎn)錄共激活作用［9］。除了核受體，SRA還可以促進不同細胞和生長環(huán)境中P53及MyoD的轉(zhuǎn)錄活性。SRA lncRNA的過表達連同MyoD一起能促進小鼠成纖維細胞向骨骼肌的橫向分化，而類固醇激素受體共激活蛋白質(zhì) (steroid receptor activator protein，SRAP)則通過結(jié)合SRA RNA阻止其與MyoD作用，進而影響肌細胞分化［10］。這是1種基因編碼2種產(chǎn)物對轉(zhuǎn)錄有相反作用的典型例子:一個起促進作用的lncRNA和一個起抑制作用的蛋白質(zhì)。

2.4 lncRNAs在可變剪接中的調(diào)控 研究還發(fā)現(xiàn)，多種lncRNAs是可變剪接的調(diào)控因子。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript l，MALAT1)的lncRNA已被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤形成、轉(zhuǎn)移以及預后不良有關(guān)［11-13］。MALAT1位于多種細胞系的核剪接斑點(splicing speckle)，通過與絲氨酸/精氨酸(serine/arginine，SR)剪接因子相互作用來調(diào)控剪接因子在剪接斑點中的分布和磷酸化水平，從而改變mRNA前體的可變剪接模式。Bemard等［14］研究發(fā)現(xiàn)MALAT1在神經(jīng)細胞中高表達，并同樣通過調(diào)控SR剪接因子影響突觸相關(guān)基因表達。

2.5 競爭性內(nèi)源lncRNAs“miRNAs海綿”已逐漸發(fā)展成為一種研究策略，在此策略中設(shè)計富含多個針對特定miRNAs靶向位點的外源性RNA分子，通過吸附細胞中miRNAs來解除其對靶基因的負性調(diào)控作用。最近的研究報道了自然存在的“miRNAs海綿”，稱它們?yōu)楦偁幮詢?nèi)源RNAs(competing endogenous RNAs，ceRNAs)［15］。其中，linc-MD1 作為 ce-RNAs之一，能結(jié)合miR-133和miR-135，從而解除其對編碼重要肌源性因子的靶基因的調(diào)控，進而激活細胞分化相關(guān)基因表達。相反，如敲低linc-MD1基因，則細胞分化進程延遲。在臨床上，杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者的成肌細胞中，linc-MD1水平顯著降低［16］。最近，有研究報道［17］內(nèi)源性環(huán)狀 RNAs(circular RNAs，circRNAs)分子在不同物種中起到”miRNAs海綿”的作用，miR-7環(huán)狀RNA海綿(circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7)包含豐富的選擇性保守miRNAs靶位點，它在人類及小鼠大腦組織中廣泛表達，通過抑制miR-7活性而導致miR-7靶基因水平增加。以上研究發(fā)現(xiàn)表明，ceRNAs可以調(diào)控不同的生物學功能，并且揭示這些lncRNAs內(nèi)部的相互作用機制可以為大部分的分化和病理進程提供重要的信息。

3 lncRNAs與細胞分化和組織器官發(fā)育

3.1 干細胞多能性與分化 一些lncRNAs已被研究確認參與維持誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)及人和鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)的多能性，并且這些lncRNAs的表達譜與控制多能性網(wǎng)絡(luò)調(diào)控有關(guān)的核心因子OCT4、NANOG、SOX2明顯相關(guān)，功能缺失試驗可以導致干細胞分化而失去多能性，或者譜系定向基因表達譜的上調(diào)［18］。在眾多的多能性相關(guān) lncRNAs中，linc-RoR(long intergenic noncoding RNA，regulator of reprogramming)在iPSCs中含量豐富，它充當一個關(guān)鍵性 ceRNA，競爭性結(jié)合 miR-145而保護OCT4、SOX2和NANOG轉(zhuǎn)錄本免受miR-145的負性調(diào)控。抑制其表達，可顯著降低細胞重編程的效率［19］，提示轉(zhuǎn)錄因子、miRNAs、lncRNAs在譜系定向過程中能形成彼此調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)。

3.2 心臟發(fā)育 有大量lncRNAs參與心肌細胞發(fā)育過程，lncRNA Bvht和lncRNA Fendrr首先在小鼠中胚層細胞中發(fā)現(xiàn)，對心臟發(fā)育具有重要作用。Bvht在胚胎干細胞中已開始表達，經(jīng)RNA干擾技術(shù)介導的敲除小鼠胚胎干細胞Bvht后，明顯影響心肌特異性基因表達水平，并阻止其分化為成熟的具有搏動能力的心肌細胞，其機制可能是Bvht可以上調(diào)一些在新生中胚層發(fā)育為心肌細胞過程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，如中胚層后蛋白(mesoderm posterior 1，MesP1)［20］，提示 Bvht可能參與心肌受損后的組織重塑。此外，Bvht也能通過與染色質(zhì)修飾復合物SUZ12結(jié)合在表觀遺傳學水平發(fā)揮調(diào)控作用。Fendrr則是小鼠側(cè)板中胚層特異表達的一種lncRNA，在體內(nèi)經(jīng)RNA干擾技術(shù)降低60%的表達水平，并未顯示明顯表型改變。相反，如果敲除小鼠胚胎Fendrr，心肌細胞數(shù)量發(fā)生明顯減少，心室壁變薄，最終導致胚胎死亡［21］，提示心肌細胞數(shù)目的減少可能因為側(cè)板中胚層向心肌細胞分化受阻所致?？傊珺vht與Fendrr在心臟發(fā)育中具有重要調(diào)控作用，使心肌細胞分化有序進行。

3.3 大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育 大腦的基因表達通常與lncRNAs有關(guān)，其中包括與大腦發(fā)育密切相關(guān)的Dlx基因家族。Guttman等［22］通過分析包括神經(jīng)前體細胞在內(nèi)的小鼠神經(jīng)元染色質(zhì)標簽，發(fā)現(xiàn)了大于1 000個保守的基因間lncRNAs，功能分析顯示，這些lncRNAs與小鼠海馬發(fā)育、少突膠質(zhì)細胞髓鞘形成、GABA能神經(jīng)元分化、G蛋白偶聯(lián)受體介導的信號轉(zhuǎn)導通路及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶依賴的信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。

此外，lncRNAS還參與到脂肪細胞分化、骨骼肌及視網(wǎng)膜等器官和組織發(fā)育等過程。

4 lncRNAs與常見惡性腫瘤的關(guān)系

在多細胞生物體內(nèi)，lncRNAs作為激活或抑制因子廣泛參與到細胞分化和個體發(fā)育進程。腫瘤為脫分化的細胞惡性增殖，理論上與這些廣泛參與到細胞分化和個體發(fā)育的lncRNAs有密切關(guān)系。腫瘤相關(guān)lncRNAs的研究正在興起，已有研究證實lncRNAs在腫瘤生物學中具有重要功能，并且在多種腫瘤中調(diào)控失調(diào)，可作為相關(guān)腫瘤早期診斷和預后判斷的重要分子生物標志物，也可為腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移治療提供新的靶點和治療思路。

HOTAIR作為組蛋白修飾復合物的支架可結(jié)合PRC2及組蛋白去甲基化酶復合體，并介導這2種復合體至特定基因位點，導致H3K27me3，從而使腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因(如JAM2、PCDH10和PCDHB5)在表觀遺傳水平上發(fā)生沉默。HOTAIR表達水平與乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)［23］。Sorensen 等［24］研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在乳腺癌原發(fā)灶及其轉(zhuǎn)移灶組織中的表達明顯不同，且轉(zhuǎn)移灶組織中HOTAIR普遍高表達。進一步的生存分析研究發(fā)現(xiàn)，相比于低表達患者，HOTAIR高表達患者的無轉(zhuǎn)移生存率明顯降低。多因素分析顯示，HOTAIR的高表達是預測病人無轉(zhuǎn)移生存率危險因素之一，且獨立于其它危險因素，如年齡、腫瘤大小、臨床分期以及雌激素受體表達等。因此HOTAIR可預測乳腺癌的轉(zhuǎn)移，并且與患者不良預后密切相關(guān)。Ishibashi等［25］通過熒光定量 PCR方法檢測64名肝癌患者中HOTAIR表達情況，并與HOTAIR低表達患者相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOTAIR高表達患者總體生存率低、腫瘤體積更大，提示HOTAIR可促進肝癌細胞增殖并且可作為肝癌預后的危險因素。盡管眾多研究表明HOTAIR與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，但其具體作用機制還有待進一步探究。

印記基因H19是較早發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，既有致癌作用，也有抑癌作用。H19在胃癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等中表達均異常。Li等［26］用lncR-NAs微陣列芯片技術(shù)檢測74對患者胃癌和癌旁組織發(fā)現(xiàn)，與正常的癌旁組織相比，H19在胃癌組織的表達明顯上調(diào)，且平均差異水平超過6倍，并且生存分析顯示高水平H19患者比低水平者預后較差，表明H19有望成為預測胃癌患者生存期的新型生物標志物及新治療靶點。H19的第1個外顯子可轉(zhuǎn)錄出miR-675。Zhu等［27］研究中發(fā)現(xiàn)，相比非前列腺癌轉(zhuǎn)移細胞株P(guān)69，印記基因H19及mir-675在前列腺癌轉(zhuǎn)移細胞株M12中的表達水平明顯下調(diào)，并且抑制參與腫瘤轉(zhuǎn)移的細胞外基質(zhì)蛋白——生長因子β誘導蛋白(transforming growth factor β-induced protein，TGFBI)的合成，可見H19還有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。H19這種雙向調(diào)控機制是源于自身特性，還是與環(huán)境因素的共同作用，仍需進一步研究。

結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(colon cancer-associated transcript 1，CCAT1)在結(jié)腸癌組織中表達高度上調(diào)。Nissan等［28］通過代表性差異分析發(fā)現(xiàn) CCAT1在結(jié)腸癌組織中表達水平高于正常黏膜組織235倍，并且在病人外周血單個核細胞中的表達水平同樣高于正常人，提示CCAT1有望成為結(jié)腸癌診斷的標志物。Mizrahi等［29］通過熒光定量PCR技術(shù)檢測19例胃癌組織﹑癌旁組織及正常胃黏膜組織的CCAT1表達水平發(fā)現(xiàn)，其在胃癌組織中的相對表達量明顯高于癌旁組織及正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義，提示CCAT1可作為胃癌早期診斷與監(jiān)測的生物標志物。也有研究［30］發(fā)現(xiàn)CCAT1在膽囊組織中表達上調(diào)，并通過結(jié)合miR-218-5p來解除其對靶基因Bmi1的負性調(diào)控，從而促進腫瘤細胞形成。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多腫瘤相關(guān)lncRNAs被發(fā)現(xiàn)。Peng等［31］通過熒光定量PCR方法檢測肝細胞癌組織及細胞系中l(wèi)ncRNA PANDAR表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織中表達水平高于正常癌旁組織，ROC為0.9564，提示 lncRNA PANDAR有望作為肝細胞癌診斷的潛在標志物。目前已發(fā)現(xiàn)體液中多種lncRNAs可作為腫瘤篩查、診斷的生物標志物，例如血液中l(wèi)ncRNA POU3F3可作為食管鱗癌的診斷指標，其與SCCA聯(lián)合檢測對于食管鱗癌的早期篩選更有意義;lncRNA PCA3在前列腺癌中表達上調(diào)，尿液中PCA3可作為前列腺癌的早期診斷標志物，小干擾RNA介導的PCA3表達下調(diào)能明顯抑制前列腺癌細胞的增長和靶基因的表達［32］，提示lncRNA PCA3可能作為前列腺癌的治療靶標;尿液lncRNA-UCA1診斷膀胱癌的敏感性和特異性分別為91.5%和96.5%［33］，ROC為0.975，提示尿液lncRNA-UCA1有望成為膀胱癌的早期篩查指標。相比于腫瘤組織，體液更易獲取和檢測，因此，體液lncRNAs有潛力作為腫瘤特異標志物應(yīng)用于臨床，并與其它腫瘤標志物相結(jié)合對腫瘤進行篩查、早期診斷和鑒別診斷，對患者療效和預后進行評估。

lncRNAs調(diào)控失調(diào)對腫瘤發(fā)生﹑發(fā)展的影響見表1。

表1 疾病相關(guān)lncRNAsTable 1.Disease-associated lncRNAs

5 總結(jié)與展望

目前在lncRNAs研究中較成熟的技術(shù)包括熒光原位雜交﹑Northern印跡﹑實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、RNA干擾﹑RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀、微陣列和RNA-Seq高通量測序，以及近年出現(xiàn)的新技術(shù)，如快速預測 RNA與蛋白質(zhì)相互作用的catRAPID、RNA純化的染色質(zhì)分離技術(shù)等。新技術(shù)的出現(xiàn)為疾病的診斷及治療帶來希望。盡管對于lncRNAs的研究得到快速發(fā)展，仍有大量基礎(chǔ)和應(yīng)用問題亟待解決。明確lncRNAs在不同類型細胞分化和個體發(fā)育過程中的調(diào)控機制，將是基礎(chǔ)研究中的核心問題。目前關(guān)于lncRNAs在疾病中的證據(jù)大多來自于表達水平上的差異，解析它們與疾病發(fā)生的因果關(guān)系和作用機制，將有可能為疾病的診斷和治療提供新的靶點和依據(jù)。另外，針對不同lncRNAs的結(jié)構(gòu)及作用方式設(shè)計新的研究技術(shù)體系也即將成為未來重要的研究方向。

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