鄭舒文，白玉娥，何炎紅，田有亮

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

沙地云杉及其近緣種遺傳多樣性研究

鄭舒文，白玉娥，何炎紅，田有亮

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對沙地云杉與近緣種的種間遺傳多樣性進(jìn)行研究，進(jìn)而分析種間的親緣關(guān)系。試驗(yàn)篩選出18個引物對紅皮云杉、嫩江云杉、長葉云杉、粗枝云杉、白杄云杉和沙地云杉6個種進(jìn)行擴(kuò)增，獲得 171 條清晰譜帶，其中多態(tài)性譜帶131條，多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)為77.78%。通過POPGENE32分析表明：觀察等位基因數(shù)(Na)為1.7778、有效等位基因數(shù)(Ne)為1.4803、Nei′s基因多樣度(He)為0.2853、Shannon多態(tài)性信息指數(shù)(I)為0.4269。采用UPGAM法聚類分析表明，6種云杉中，沙地云杉與白杄云杉親緣關(guān)系最近，紅皮云杉與嫩江云杉親緣關(guān)系相對較近。研究結(jié)果可為云杉屬的遺傳評價、系統(tǒng)進(jìn)化、物種鑒定和種間雜交育種提供參考。

云杉；ISSR；遺傳多樣性；親緣關(guān)系

云杉屬(Picea)為松科常綠喬木。全球約有40種，主要分布在北緯50°—60°的寒溫帶或凍原地帶，少數(shù)分布在溫帶和亞熱帶的濕冷亞高山帶上[1]；我國云杉樹種分布較多，共有16種9變種，大多分布于東北、華北、西北、西南及臺灣等地區(qū)[2]。云杉屬植物樹干高大通直，節(jié)少，材質(zhì)略輕柔、結(jié)構(gòu)細(xì)致，既是纖維造紙的良材，又是建筑優(yōu)良用材樹種。

沙地云杉(Piceamongolica)是中國稀有珍貴樹種，集中成片的分布在生態(tài)環(huán)境惡劣的內(nèi)蒙古自治區(qū)以克什克騰旗的白音敖包自然保護(hù)區(qū)，形成了罕見的沙地森林。沙地云杉具有耐旱抗寒、防風(fēng)阻沙、調(diào)節(jié)氣候等特點(diǎn)，并且生存年代久遠(yuǎn)，所以被稱為沙漠上的“綠寶石”和“生物活化石”[3]。多年來沙地云杉的歸屬和云杉屬種間親緣關(guān)系的確定成為植物分類學(xué)界爭論不休的問題。沙地云杉?xì)w屬問題沒有得到解決，甚至嚴(yán)重影響了科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐。隨著研究的深入，許多學(xué)者對云杉屬植物進(jìn)行外部形態(tài)特征、生理生化、同工酶測定、核型分析、分子標(biāo)記等諸多方面的研究[4-7]，獲得很多有價值的數(shù)據(jù)。其中為了確定沙地云杉與近緣種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，蔡萍等[8]應(yīng)用RAPD標(biāo)記對沙地云杉與近緣種紅皮云杉和白杄云杉的遺傳多樣性進(jìn)行分析，討論三者之間的遺傳多樣性水平的差異，探討沙地云杉與其近緣種紅皮云杉和白杄云杉之間的演化歷史和親緣關(guān)系。但是在眾多研究中，與沙地云杉對比研究的云杉屬植物僅限于紅皮云杉和白杄云杉，而且云杉屬幾種樹種種間的遺傳多樣性關(guān)系未見報(bào)道。

由于分子標(biāo)記可以在DNA水平上更為清晰地反映物種間的遺傳多樣性。而且ISSR 標(biāo)記技術(shù)相對于其他標(biāo)記的優(yōu)勢在于簡單方便：首先，不需要知道 SSR 兩側(cè)的保守序列，省去了設(shè)計(jì)引物、同位素顯示、構(gòu)建文庫等過程；穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，多態(tài)性高；試驗(yàn)成本低。所以目前已被廣泛用于作物遺傳育種、植物品種鑒定、基因定位和遺傳圖譜構(gòu)建等研究中[9-13]。本研究從DNA水平上著手，首次利用ISSR分子標(biāo)記的方法對紅皮云杉(P.koraiensis)、嫩江云杉(P.koraiensisvar.nenjiangensis)、長葉云杉(P.smithiana)、粗枝云杉(P.asperata)、沙地云杉、白杄云杉(P.mongolica)之間的遺傳多樣性進(jìn)行分析，確定它們之間的親緣關(guān)系。探討云杉屬樹種種間親緣關(guān)系及系統(tǒng)分類學(xué)地位，不僅進(jìn)一步明確沙地云杉與其他云杉之間的遺傳差異，更為云杉屬的遺傳評價、物種鑒定和種間雜交育種提供依據(jù)，云杉樹種的研究也為裸子植物分子細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究提供可行的方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

6種云杉(紅皮云杉、嫩江云杉、長葉云杉、粗枝云杉、沙地云杉、白杄云杉)種子都來自天然群落，每種云杉都是在生長最好的代表區(qū)域，抽取10個植株，并采集當(dāng)年球果，分裝在透明的袋子，從球果中取出種子，放在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，試?yàn)材料的相關(guān)信息見表1。

表1 6種云杉的相關(guān)信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 云杉基因組DNA提取 把保存在冰箱里的每個樹種種子取出，相同的生長條件，分別培養(yǎng)在10個濕潤的培養(yǎng)皿中。長出嫩葉后，把10個培養(yǎng)皿里的嫩葉取出，每個培養(yǎng)皿的嫩葉分別取1000 mg，全部裝入5個2 mL離心管，每個離心管里裝200 mg，研磨后放入1.5 mL離心管，每個樹種50個重復(fù)，采用CTAB法，提取云杉葉片基因組DNA。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，用分光光度計(jì)測定其濃度，最后UVP型凝膠成像分析儀拍照記錄，篩選出DNA條帶清晰的樣本，在-20 ℃的條件下保存，作為PCR的模板，分析種間的遺傳多樣性。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系及程序 ISSR擴(kuò)增反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化確定20 μL的PCR反應(yīng)體系，其中Taq Mix 10 μL，water 8μL，10 μm引物1 μL，模板50 ng。加拿大哥倫比亞大學(xué)提供的引物序列，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 4 min，94 ℃變性 45 s，72 ℃延伸2 min，40 個循環(huán)，最后 72 ℃充分延伸7 min，4 ℃保存，PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖(每 100 mL加入2 μL核酸染料)電泳45 min，電壓120 V。緩沖液是0.5×TBE，最后在UVP凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對電泳圖譜中清晰可見的條帶進(jìn)行記錄，在相同的位置有條帶的記做“1”，沒有條帶的記作“0”，建立“0-1”二元數(shù)據(jù)矩陣。采用POPGEN 32軟件，計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei′s基因多樣度(He)和Shannon多態(tài)性信息指數(shù)(I)。通過NTsys 2.10e軟件，計(jì)算各供試材料間的相似性系數(shù)，采用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，獲得聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選和ISSR擴(kuò)增分析

利用優(yōu)化的反應(yīng)體系從100條ISSR引物中篩選18個條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物進(jìn)行分析(表2)。18個引物對長葉云杉、紅皮云杉、嫩江云杉、粗枝云杉、沙地云杉、白杄云杉6種云杉共擴(kuò)增出171條譜帶，其中有133多態(tài)性DNA條帶，多態(tài)性條帶的比例的平均值是77.78%。表明6種云杉的條帶多態(tài)性大。擴(kuò)增條帶大多在500～2000 bp之間。每個引物擴(kuò)增出7～12條不等的條帶，擴(kuò)增條帶數(shù)的平均值為9.5，多態(tài)性條帶的均值為7.39。多態(tài)性百分率最高達(dá)到90.9%，最低42.86%。由圖1可以看出，同一個引物下，6種云杉擴(kuò)增出不同的譜帶，但是可以從譜帶的位置清晰地看出6種云杉在DNA上的差異。

表2 18條ISSR引物序列及其PCR擴(kuò)增

1～4為紅皮云杉；5～8為嫩江云杉；9～12為長葉云杉；13～16為粗枝云杉；17～20為沙地云杉；21～24為白杄云杉。 圖1 引物UBC834對6個云杉種的ISSR擴(kuò)增圖譜

2.2 6種云杉的遺傳多樣性分析

觀測等位基因(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei′s基因多樣度(He)與Shannons信息指數(shù)(I)是度量遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)，運(yùn)用POPGENE 32對云杉屬6個種進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。長葉云杉、紅皮云杉、嫩江云杉、粗枝云杉、沙地云杉、白杄云杉6種云杉種間的Na為1.7778，Ne為1.4803。由于有效等位基因數(shù)是反映群體遺傳變異大小的一個指標(biāo)，其數(shù)值越接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻[14]。6個云杉種間有效等位基因和觀測等位基因相差0.300，差值相對較小，說明等位基因在群體中分布均勻。6種被試云杉樹種總的基因多樣性指標(biāo)He(0.2853)和I(0.4269)值相對較小，所以親緣關(guān)系相對較近，遺傳多樣性不高。

2.3 遺傳距離和親緣關(guān)系的聚類分析

遺傳距離是評價種間遺傳變異水平的重要指標(biāo)，遺傳距離越小，親緣關(guān)系越近，遺傳距離越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。通過PopGen32計(jì)算Nei′s遺傳距離(D)，分析云杉屬之間的遺傳關(guān)系(表4)，6種云杉種間的遺傳距離分布在0.1047～0.7596之間。其中沙地云杉與白杄云杉遺傳距離為0.1047，距離最小，說明這2種云杉的親緣性相對較近；長葉云杉與白杄云杉的遺傳距離是0.7596，距離最大，這2個樹種的親緣性較遠(yuǎn)。紅皮云杉與沙地云杉之間的遺傳距離為0.5544，距離相對比較大。

表3 6個云杉種間的遺傳多樣性分析

利用UPGMA法構(gòu)建居群遺傳關(guān)系聚類圖(圖2)。從聚類圖可見，在0.8的區(qū)分度下可分為4類；紅皮云杉和嫩江云杉聚為一類，沙地云杉和白杄云杉聚為一類，粗枝云杉和長葉云杉各為一類。在0.71的區(qū)分度下可分為3類：紅皮云杉、嫩江云杉、沙地云杉、白杄云杉聚為一類，粗枝云杉、長葉云杉各為一類。根據(jù)種間遺傳一致度、遺傳距離和聚類分析指出，在6種被試云杉中沙地云杉與白杄云杉親緣關(guān)系最近。

表4 6種云杉種間遺傳一致度和遺傳距離

*：上三角為遺傳一致度；下三角為遺傳距離；1～6分別為長葉云杉、紅皮云杉、嫩江云杉、沙地云杉、白杄云杉、粗枝云杉。

3 結(jié)論與討論

ISSR分子標(biāo)記探討植物種間的親緣關(guān)系已有較多的報(bào)道[9-15]。目前，ISSR 標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物物種鑒定、指紋圖譜、遺傳多樣性、基因定位及分子生態(tài)學(xué)研究。Scheepers D等[15]用160條引物對9個挪威云杉群體的180個個體進(jìn)行RAPD分析，其中156條引物擴(kuò)增出998條帶，平均每條引物擴(kuò)增出6.4條RAPD帶，78(7%)條擴(kuò)增帶是多態(tài)的。蔡萍等[8]應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)對內(nèi)蒙古沙地云杉8個居群及其近緣種紅皮云杉10個居群、白杄云杉10個居群的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，所用的16個隨機(jī)引物在28個居群中共檢測到172個位點(diǎn)，平均每個引物擴(kuò)增帶數(shù)為10.75條，其中多態(tài)位點(diǎn)119個，占69.19%，表現(xiàn)出豐富的RAPD多態(tài)性。本研究從100個ISSR引物中篩選出18條有效引物，擴(kuò)增出171條條帶，平均每個引物擴(kuò)增出9.5條，其中多態(tài)性條帶133條，占77.78%。說明ISSR標(biāo)記比RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性高，能擴(kuò)增出更多的遺傳多態(tài)性位點(diǎn)；而且ISSR多態(tài)性檢測效率更高，表明遺傳多樣性參數(shù)較大，多態(tài)性位點(diǎn)比例在親緣關(guān)系較近的云杉種內(nèi)較高，適合親緣關(guān)系較近的種群間遺傳多樣性分析。本文結(jié)果指出，6種被試云杉樹種總的基因多樣性指標(biāo)He(0.2853)和I9(0.4269)值相對較小，說明6種被試云杉種間遺傳多樣性也相對較小。

蔡萍等[8]運(yùn)用沙地云杉與近緣種紅皮云杉和白杄云杉遺傳多樣性的RAPD分析，對沙地云杉、紅皮云杉和白杄云杉的Nei′s多樣性指數(shù)和Shannon′s多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，得出8個沙地云杉居群、10個紅皮云杉居群和10個白杄云杉居群間具有一致的變異趨勢。根據(jù)遺傳距離和聚類分析，3種云杉聚為3大類，沙地云杉與白杄云杉的親緣關(guān)系較與紅皮云杉近，表明經(jīng)過漫長的進(jìn)化，沙地云杉產(chǎn)生了較大的遺傳變異，因此支持將沙地云杉劃分為獨(dú)立種。本試驗(yàn)通過ISSR標(biāo)記對云杉屬的6個種云杉的擴(kuò)增結(jié)果表明，種間的遺傳距離在0.1047～0.7596之間，說明云杉種間的遺傳多樣性豐富。根據(jù)遺傳一致度、遺傳距離和聚類分析進(jìn)一步說明沙地云杉和白杄云杉的親緣性較近，而與紅皮云杉較遠(yuǎn)。

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The Interspecific Geneticdiversity ofPiceamongolicaand its Relative Species

ZHENG Shu-wen，BAI Yu-e，HE Yan-hong，TIAN You-liang

(ForestryCollege，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010019，Neimenggu，China)

The interspecific genetic diversity and relationship ofPiceamongolicaand its relatives was studied by ISSR molecular marker technology.18 primers were selected for amplification inPiceakoraiensis，P.koraiensisvar.nenjiangensis，P.smithiana，P.asperata，P.meyeriandP.mongolica.171 clear bands were obtained among which 131 were polymorphic，and percentage of polymorphic loci (PPB) was 77.78%.The result showed that observed number of alleles (Na) was 1.7778，effective number of alleles (Ne) was 1.4803，Nei′s gene diversity (He) was 0.2853，and Shannon polymorphism information index(I) was 0.4269.The cluster analysis showed thatPiceamongolicahad a close phylogenetic relationship toPiceameyeri，andPiceakoraiensishad a closer phylogenetic relationship toP.koraiensisvar.nenjiangensisin 6 spruce species.The experiment provided a theoretical basis for genetic evaluation，systematic，species identification and interspecies hybridization ofPicea.

Piceamongolica；ISSR；genetic diversity；phylogenetic relationship

2014-09-21；

2014-10-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160166)；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)灌木樹種新品種選育科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

鄭舒文(1990—)，女，遼寧本溪人，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院碩士研究生，從事森林培育理論與技術(shù)的研究。E-mail：eliane150@163.com。

何炎紅。E-mail：hyh20012008@imau.edu.cn。

10.13428/j.cnki.fjlk.2015.03.005

S791.18

A

1002-7351(2015)03-0024-05