劉金豆，劉　麗，黃元佳

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院//南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物增養(yǎng)殖廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心 廣東 湛江 524088）

稀杯盔形珊瑚轉(zhuǎn)錄組分析

劉金豆，劉麗，黃元佳

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院//南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物增養(yǎng)殖廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心 廣東 湛江 524088）

以高通量測序技術(shù)Illumina HiSeqTM2000對稀杯盔形珊瑚（Galaxea astreata）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，共獲得50 360 620條短序列 (reads)。利用Trinity軟件對所有reads從頭組裝后得到81 014條單基因簇(Unigenes)，60 471條(74.58%)編碼蛋白框（Coding Sequences,CDs）。與N（rNon-redundant, 非冗余）、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins, 蛋白相鄰類的聚簇）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, 京都基因與基因組百科全書）、Swissprot四大數(shù)據(jù)庫比對共獲得36 545條注釋基因。其中與COG數(shù)據(jù)庫比對獲得14 491條注釋基因，分為24個(gè)功能類別，其中參與一般功能預(yù)測類的Unigene數(shù)最多，有4 642條；KEGG分析比對獲得16 021條注釋基因，分成241類，包括代謝通路、鈣離子信號通路、MAPK信號通路等,在所有通路中參與代謝途徑的基因數(shù)最多，共有2 450條(15.29%)；GO(Gene Ontology, 基因本體)功能分類將Unigene分為47個(gè)類別。

轉(zhuǎn)錄組；稀杯盔形珊瑚；Unigene；信號通路

珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是全球最大的生態(tài)系統(tǒng)之一，在熱帶海洋環(huán)境中扮演著極為重要的角色。近年由于溫度變化、海洋酸化、海水污染等環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)珊瑚礁大面積白化和死亡[1-3]。李淑等[4]在珊瑚礁白化研究進(jìn)展中從細(xì)胞機(jī)制和光抑制機(jī)制兩個(gè)方面綜述了珊瑚白化的機(jī)制，但尚未研究清楚?；?qū)用嫔希捎谏汉餮芯科鸩酵?，缺乏珊瑚基因信息，使得分子層面上珊瑚的白化機(jī)制也十分模糊[5-6]。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得珊瑚基因信息和功能，了解珊瑚的轉(zhuǎn)錄組特征，將有助在基因水平上揭示珊瑚的白化機(jī)制。

轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)是指細(xì)胞或組織所表達(dá)的所有RNA總和。它反映特定條件下細(xì)胞或組織內(nèi)的基因表達(dá)情況和生物學(xué)代謝途徑的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是最近發(fā)展起來的利用深度測序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù),該技術(shù)能提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息，且具有靈敏度高、分辨率高、重復(fù)性好的特性。目前，該技術(shù)已經(jīng)大規(guī)模應(yīng)用。2009年Feng等[7]對靜水椎實(shí)螺（Lymnaea stagnalis）中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，獲得7 712條EST序列，注釋得到了很多基因。同年，Eli Meyer[8]等人首次將高通量測序技術(shù)應(yīng)用到珊瑚上，獲得了大量的珊瑚基因和注釋信息。2011年Wei等[9]利用該技術(shù)進(jìn)行芝麻轉(zhuǎn)錄組研究,并對芝麻轉(zhuǎn)錄組整體特征進(jìn)行了初步的分析，獲得86 222條Unigene序列，在很大程度上豐富了芝麻生物信息數(shù)據(jù)。除此之外，還有大量生物進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，如模式生物中的玉米（Zea mays L.）[10-11]、擬南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh）[12-13]等；非模式生物中的油菜（Brassica campestris L.）[14]、白鮭（Salmonidae）[15-16]、大比目魚（Hippoglossus stenolepis）[17]等。

稀杯盔形珊瑚(Galaxea astreata) 隸屬于枇杷珊瑚科，盔形珊瑚屬。本研究以廣東徐聞縣珊瑚礁國家級自然保護(hù)區(qū)一種造礁石珊瑚——稀杯盔形珊瑚為研究對象，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析。由于受到環(huán)境變化的影響，導(dǎo)致保護(hù)區(qū)內(nèi)珊瑚礁數(shù)量逐年減少，稀杯盔形珊瑚即為受害者之一。自2009年以來，本課題組從分子分類[18-19]、性腺發(fā)育[20]以及功能基因克隆[21]等方面對稀杯盔形珊瑚進(jìn)行了研究。本研究通過高通量測序技術(shù)對該珊瑚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，以期豐富該珊瑚的轉(zhuǎn)錄組特征和信息，以及為珊瑚礁的保護(hù)和修復(fù)提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

稀杯盔形珊瑚(Galaxea astreata )樣本均采自廣東省湛江市徐聞珊瑚礁國家級自然保護(hù)區(qū)(20°10′36″N—20°27′00″N)。于室內(nèi)循環(huán)水族箱暫養(yǎng)15 d左右,自然光照11～12 h·d–1, 海水水溫為（27±1.0）,℃ 每周更換1/3 體積海水并清洗水循環(huán)系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1RNA的提取剪取珊瑚蟲體3～5個(gè)，采用Connolly et al[22]的Trizol法提取珊瑚總RNA, -80℃長久保存。部分RNA送廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行檢測、建庫、組裝、測序等。

1.2.2RNA的質(zhì)量檢測和文庫的構(gòu)建稀杯盔形珊瑚總RNA經(jīng)Aglilent 2100檢測，符合轉(zhuǎn)錄組RNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)[質(zhì)量濃度≥200 ng/μL，總量≥10～15 μg，OD260/280在1.8～2.2范圍，RNA Ratio (28S∶18S) ≥1 , RIN≥7.5]后，進(jìn)行建庫。

樣品總RNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù), 加poly（A）并連接測序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序文庫建好后用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測序。

1.3數(shù)據(jù)處理

1.3.1初始數(shù)據(jù)處理測序產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(raw reads)，過濾后得到clean reads。

1.3.2序列組裝使用短 reads 組裝軟件 Trinity做轉(zhuǎn)錄組從頭組裝。首先將具有一定長度overlap的reads連成更長的片段，從這些通過reads overlap關(guān)系得到的不含N的組裝片段得到組裝出來的 Unigene。

1.3.3功能注釋及編碼蛋白框（CDS）的預(yù)測通過blastx將Unigene序列比對到Nr (Non-redundant,非冗余)、COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins,蛋白相鄰類的聚簇)、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,京都基因與基因組百科全書)、Swissprot四大蛋白質(zhì)據(jù)庫（evalue<0.000 01）。獲取跟給定 Unigene 具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該 Unigene 的蛋白功能注釋信息。對blast比對結(jié)果中rank最高的蛋白確定該Unigene的編碼區(qū)序列，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)密碼子表將編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列，從而得到該Unigene編碼區(qū)的核酸序列（序列方向5'->3'）和氨基酸序列。最后，與以上蛋白庫均比對不上的Unigene用軟件ESTScan預(yù)測其編碼區(qū)，獲取其編碼區(qū)的核酸序列（序列方向5'->3'）和氨基酸序列。

2　結(jié)果與分析

測序共獲得50 360 620條clean reads，Q20（質(zhì)量不低于20的堿基比例）達(dá)到96.44%，不確定的堿基比例為0，GC%值為49.65%。由此可見此次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果較好，可以進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)組裝和分析。組裝拼接后獲得81014條unigene，N50（將所有 Unigene 從長到短排序，并依次累加長度。當(dāng)累加片段長度達(dá)到總片段長度的50%時(shí)，對應(yīng)片段的長度和數(shù)量，即為Unigene N50長度和數(shù)量）為1 096。這些Unigene中長度最長的為18 230 nt，最短的為201 nt，平均長度為751.55 nt。整體看來，本研究測序結(jié)果較好。

2.1Unigene長度分布

從稀杯盔形珊瑚的Unigene長度分布（圖1）中看出，所有Unigene的長度都大于等于200 nt。長度在200～299 nt的Unigene數(shù)目最多為19 869條，其次為長度大于或等于3 000 nt的Unigene數(shù)為1 419條。而長度在2 900～2999 nt的Unigene數(shù)目最少為149條。

圖1　稀杯盔形珊瑚的Unigene長度分布Fig.1　Length distribution of Galaxea astreata-Unigene

2.2Unigene的功能注釋

通過與Nr、COG、KEGG、Swissprot等四大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對共獲得36 545條注釋基因。Nr數(shù)據(jù)庫比對注釋獲得的Unigene數(shù)最多，為35 548條。占總Unigene數(shù)的43.88%。KEGG數(shù)據(jù)庫比對注釋的Unigene數(shù)最少，為16 021條，占總Unigene數(shù)的19.78%。COG、Swissprot數(shù)據(jù)庫比對注釋的Unigene數(shù)分別為14 491條和27 872條。未注釋的Unigene數(shù)為44 469條，占總Unigene的比率為54.89%，超過Unigene總數(shù)的一半以上。在Unigene與四大數(shù)據(jù)庫比對注釋時(shí)，有一些Unigene基因會在數(shù)據(jù)庫中重復(fù)出現(xiàn)，多次被注釋。稀杯盔形珊瑚的四大數(shù)據(jù)庫注釋維恩圖簡明清晰的展示出四大數(shù)據(jù)庫注釋的Unigene之間的關(guān)系（圖2）。由圖2可見，共同注釋的Unigene數(shù)為9 089條，占注釋的Unigene總數(shù)的24.87%。

圖2　稀杯盔形珊瑚的四大數(shù)據(jù)庫注釋維恩Fig.2　Venn of the four databases Galaxea astreata-unigene

2.3Unigene的功能分類

2.3.1Unigene的COG分類COG功能分類將Unigene分為24個(gè)類別，如圖3所示。從圖中看出Unigene的COG功能種類比較全面，幾乎包含了所有的生命活動。參與一般功能預(yù)測類的Unigene數(shù)最多，有4 642條，所占比率為32.03%。細(xì)胞核結(jié)構(gòu)功能類別含有的Unigene只有9條，所占比率為0.62%，是所有類別中Unigene數(shù)最少的。其他的功能分類詳見圖3。

圖3　稀杯盔形珊瑚的Unigene COG功能分類Fig.3　COG Function Classification of Galaxea astreata-Unigene

2.3.2Unigene的KEGG分類與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得16 021條注釋Unigene，分為241條途徑，包括代謝通路、MAPK信號通路、鈣離子信號通路、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工過程、細(xì)胞周期、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等多種途徑。部分途徑列于下表1。從表1中可見，代謝途徑所占有的Unigene數(shù)最多，為2 450，占15.29%。其次為MAPK信號通路，共有Unigene數(shù)為657條，所占比率為4.1%。鈣離子信號通路所占有的Unigene數(shù)為610條，占3.81%，位居第三。

表1　稀杯盔形珊瑚Unigene的KEGG功能分類Table 1　KEGG function Classification of Galaxea astreata-Unigene

2.3.3Unigene的GO分類如圖4所示，GO功能分類將注釋的Unigene分為3類：生物過程、細(xì)胞組成和分子功能，共47個(gè)分支。其中生物過程包含23個(gè)不同的類別，是三大類別中所含類別最多的一類。所含類別如下：細(xì)胞生理過程、新陳代謝的過程、生物調(diào)節(jié)、生長、死亡等。細(xì)胞生理過程包含的Unigene數(shù)目最多為8 185條，其次為新陳代謝的過程，有7 192條Unigene。死亡類別的Unigene數(shù)最少，只有8條。

細(xì)胞組成和分子功能又分別分為13和11個(gè)類別。細(xì)胞組成中所含Unigene數(shù)最多的類別為細(xì)胞，擁有7 993條Unigene。細(xì)胞部分包含的Unigene數(shù)比細(xì)胞類只少兩條，位列第二。而突觸部分僅僅有35條Unigene，是細(xì)胞組成中Unigene數(shù)目最少的一類。分子功能中的催化活性所占有的Unigene數(shù)最多有7 359條。電子轉(zhuǎn)運(yùn)活性所占Unigene數(shù)最少，只有10條。

2.4編碼蛋白框（CDs）的預(yù)測

通過blastx比對（evalue < 0.000 01）和ESTScan預(yù)測Unigene編碼區(qū)，得到其編碼框。兩者共得到編碼蛋白框60 471條（74.58%），大部分Unigene的蛋白編碼框已經(jīng)得到預(yù)測。其中blast比對得到36 564條CDs，占總Unigene 數(shù)的比為45.13%，ESTScan預(yù)測得到的CDs為23 907條，占Unigene總數(shù)的29.51%。各自得到的CDs長度分布圖具體如圖5和圖6所示，由圖可知，所得CDs的長度在200～299 nt之間所占比例最大。

圖4　稀杯盔形珊瑚的Unigene GO功能分類Fig.4　GO class of Galaxea astreata-Unigene

3　討論

本研究通過Illumina HiSeqTM2000對稀杯盔形珊瑚（Galaxea astreata）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得50 360 620 reads，組裝后獲得81 014條Unigene。比對后得到36 545條注釋基因，未注釋的基因有44 469條，占總Unigene的百分比為54.89%。出現(xiàn)大量未能注釋的Unigene大致包括以下2個(gè)因素。

（1）珊瑚基因信息的缺乏。相對于其他物種如：擬南芥、斑馬魚而言，珊瑚的研究起步較晚，目前關(guān)于珊瑚基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究很少，其數(shù)據(jù)庫信息不足，缺乏可供參考的基因組信息。這致使對基因進(jìn)行功能注釋時(shí)往往找不到對應(yīng)的注釋信息。

（2）測序技術(shù)的局限性。高通量測序技術(shù)雖然有很多的優(yōu)勢，但是同時(shí)也存在一定的不足。由于珊瑚沒有參考基因組信息，只能進(jìn)行重頭轉(zhuǎn)錄組測序分析。重頭組裝測序中序列長度較短的會影響后期數(shù)據(jù)質(zhì)量。根據(jù)魏利斌等[23]的研究認(rèn)為轉(zhuǎn)錄組序列越短，獲得注釋信息的可能性就越小。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果Unigene長度分布圖和N50值的大小來看，Unigene長度都是在200 nt及其以上，N50值為1 096（Unigene N50越長，數(shù)量越少，說明組裝質(zhì)量越好。)，說明本實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)較好。同時(shí)，將NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的10條稀杯盔形珊瑚的基因序列與本研究測序結(jié)果進(jìn)blast比對發(fā)現(xiàn)，10條序列都能夠比對至本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)庫中，并且序列之間的相似程度很大，可靠性很高。如，將NCBI中稀杯盔形珊瑚的Fe基因序列(登錄號：KJ59 1050.1）與本研究測序的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行本地blast比對，找到了其對應(yīng)的基因，并且結(jié)果顯示其S值為1 489 Bits，E值為0.0，表明兩序列具有高度同源性，并且可靠性很高，說明本研究測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性較高。

圖6　ESTscan預(yù)測的CDs長度分布Fig.6　Length distribution of ESTscan.CDs

與Nr、COG、KEGG、Swissprot等四大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對共獲得36 545條注釋基因。GO功能分類中細(xì)胞生理過程包含的Unigene數(shù)目最多為8 185條，其次為新陳代謝的過程，有7 192條Unigene；死亡類別的Unigene數(shù)最少，僅有8條。KEGG數(shù)據(jù)庫比對共注釋16 021條Unigene，分為241條途徑，其中代謝途徑的Unigene數(shù)最多，有2 450條，所占比例為15.29%。鈣離子信號通路的Unigene數(shù)為610條，所占比例為3.81%，位居第三。GO功能分類與KEGG Pathway分析結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)珊瑚代謝相關(guān)的Unigene數(shù)目幾乎都是最多，表明珊瑚在生長生活過程中代謝活動非常旺盛。從KEGG Pathway分類結(jié)果看參與珊瑚鈣離子信號通路的Unigene數(shù)目很多，說明珊瑚鈣化在珊瑚生長過程中具有重要作用。Souter P等[24]人的研究表明珊瑚白化中珊瑚Ca2+平衡失調(diào)，這說明鈣化基因參與調(diào)解珊瑚的白化。本研究轉(zhuǎn)錄組測序找到了鈣離子信號通路，并發(fā)現(xiàn)了相關(guān)鈣化基因，這為研究其調(diào)控機(jī)制，揭示珊瑚白化機(jī)制提供可能，也為珊瑚的保護(hù)提供理論基礎(chǔ)和研究方向。

廣東省徐聞縣徐聞珊瑚礁國家級自然保護(hù)區(qū)給予本研究幫助和支持，特致謝忱！

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（責(zé)任編輯：陳莊）

Transcriptome Analysis of Galaxea astreata

LIU Jin-Dou，LIU Li，HUANG Yuan-Jia
（Fisheries College，Guangdong Ocean University//Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal of Guangdong Higher Education Institutes//South China Sea Bio-Resource Exploitation And Utilization Collaborative Innovation Center，Zhanjiang 524088，China）

High-throughput sequencing technology Illumina HiSeqTM2000 was used to sequence the Galaxea astreata transcriptome，and 50 360 620 reads were got in all.And then assembled software Trinity was used to denovo assembled the reads,getting 81014 Unigenes and 60 471 Coding Sequences(CDs). Blasted with the four database Nr(Non-redundant), COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)，KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes), Swissprot，36 545 annotated Unigenes were gotten. Blasted with COG database，14 491 unig- enes were gained and according to the function it was divided into 24 categories. 4 642 Unigenes join in the general function prediction only category, which own the most numbers of Unigenes. Blasted with KEGG pathway，16 021 Unigenes were annotated, and it was divided into 241 categories according to different pathways，including metabolic pathway, calcium signaling pathway, and MAPK signaling pathway and so on. Of all the pathways, the number of genes join in the metabolic pathways was maximum in 2450 (15.29%). GO(Gene Ontology)functional classification divided all Unigenes into 47 categories. Through this study，a lot of Galaxea astreata coral Unigenes were gotten. It can help us find some new functional genes and to know about the growth of coraland adaptation to the environment changes.

transcriptome；Galaxea astreata；Unigene；signal pathway

S917.4

A

1673-9159（2015）06-0001-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2015.06.001

2015-09-21

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201105012);廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2011010000269); 廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)(A201308E02)

劉金豆（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ蠼?jīng)濟(jì)動物發(fā)育生物學(xué)的研究。E-mail:735677865@qq.com

劉麗，女，教授，主要從事海洋經(jīng)濟(jì)動物發(fā)育生物學(xué)的研究。E-mail:zjouliuli@163.com.