湯保貴，楊思楷，鄭素碧，倪芙镕，周星星，徐月容，謝偉瑩

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

MS-222和苯唑卡因麻醉后羅非魚血清電解質(zhì)變化及其與紅細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性

湯保貴，楊思楷，鄭素碧，倪芙镕，周星星，徐月容，謝偉瑩

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

分別用3個(gè)濃度梯度的MS-222和苯唑卡因?qū)Γ?.05±1.71）g的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）進(jìn)行6 h浸泡式麻醉，抽取尾部靜脈血，研究血清中K+、Na+、Cl-、Ca2+等4種無機(jī)離子水平變化以其與紅細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果表明：1）隨MS-222質(zhì)量濃度的升高，血清中K+濃度呈持續(xù)下降趨勢，Na+濃度保持相對穩(wěn)定，Cl-濃度逐步升高，Ca2+濃度呈現(xiàn)出峰谷式波動(dòng)，各離子濃度變化與紅細(xì)胞數(shù)之間相關(guān)系數(shù)絕對值大小依次為Cl-（0.911 6）、K+（-0.551 9）、Na+（0.337 5）、Ca2+（0.208 9），紅細(xì)胞數(shù)升高的同時(shí)發(fā)生了Cl-外流；2）隨苯唑卡因質(zhì)量濃度的升高，血清中K+濃度呈峰谷式波動(dòng)，Na+濃度亦保持相對穩(wěn)定，Cl-濃度呈現(xiàn)小幅波動(dòng)，Ca2+濃度基本呈下降趨勢，離子濃度與紅細(xì)胞數(shù)之間相關(guān)系數(shù)絕對值大小依次為Ca2+（0.970 1）、Na+（0.315 2）、Cl-（0.265 3）、K+（-0.049 9），紅細(xì)胞數(shù)降低的同時(shí)發(fā)生了Ca2+內(nèi)流；3）兩種藥物處理后，離子之間的相關(guān)性大小次序基本一致，均為K+-Na+最高，其次是K+-Cl-和Na+-Cl-。

尼羅羅非魚；麻醉；MS-222；苯唑卡因；無機(jī)離子；紅細(xì)胞

為降低對魚采血、埋植藥物、人工標(biāo)記等操作時(shí)魚的疼痛感和操作應(yīng)激，避免意外受傷，需對魚類進(jìn)行麻醉。此外，活魚運(yùn)輸中麻醉劑的使用還可有效降低其呼吸頻率與耗氧量，提高運(yùn)輸密度與成活率[1-2]。3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽（商品名metacaine，別名MS-222）作為一種鎮(zhèn)靜劑有使用方便（水溶性）、效力迅速、蘇醒快、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是迄今唯一被美國國家食品及藥品管理局（FDA）及環(huán)境保護(hù)署（EPA）批準(zhǔn)的漁用麻醉劑[1]，但需21 d的停藥期。對氨基苯甲酸乙酯（商品名benzocaine，別名苯唑卡因）通常用作醫(yī)學(xué)局部麻醉劑[2-3]，因其安全邊際較大[4-5]，藥物殘留低（組織中含量可在24 h內(nèi)降至檢測水平以下）[6]，毋需停藥期[7]，與MS-222一并被挪威批準(zhǔn)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[8]。

我國漁用麻醉劑的應(yīng)用歷史不長，僅有對美洲鰣（Alosa sapidissima）、斑馬魚（Danio rerio）、黃臘鲹（Trachinotus blochii）等少數(shù)魚類的研究[9-15]，主要側(cè)重于行為描述及耗氧量、排氨率等表觀生理指標(biāo)監(jiān)測。在羅非魚（Oreochromis niloticus）方面，筆者已研究上述兩種麻醉劑的急性毒性，并模擬運(yùn)輸過程，研究兩者對魚體的耗氧率、排氨率以及與攜氧相關(guān)的血液指標(biāo)等的影響[16-19]，發(fā)現(xiàn)羅非魚經(jīng)MS-222麻醉后，紅細(xì)胞數(shù)目（erythrocyte amount, Er）會(huì)緩慢增加；而經(jīng)苯唑卡因麻醉后，Er急劇下降，且變化均呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。這種現(xiàn)象在對虹鱒(Salmo gairdneri)[20]、西伯利亞鱘（Acipenser baeri）[21]、石脂鯉（Brycon cephalus）[22]的研究中也有報(bào)道。

關(guān)于麻醉劑對魚類血清離子濃度的影響方面，學(xué)界已對羅非魚（O. niloticus）[23]、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）[23]、西伯利亞鱘（A. baeri）[24]、美洲鰣 (A. sapidissima)[25]、真鯛(Pagrus pagrus)[26]等進(jìn)行了研究，但未將其與紅細(xì)胞數(shù)變化進(jìn)行聯(lián)合分析。本研究通過分析血清中無機(jī)離子濃度與紅細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性，從無機(jī)離子跨紅細(xì)胞膜流動(dòng)和血漿電解質(zhì)水平變化的角度，解釋兩種麻醉劑對羅非魚紅細(xì)胞生理效應(yīng)的差異。

1　材料與方法

1.1材料

羅非魚由廣東羅非魚良種場提供，為“廣特超”?新吉富羅非魚，體長（6.86±0.71）cm，體質(zhì)量（6.05±1.71）g。MS-222購自杭州動(dòng)物藥品廠（純度99%），苯唑卡因購自武漢遠(yuǎn)誠科技發(fā)展有限公司（純度98%）。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

兩種藥物分別設(shè)3個(gè)質(zhì)量濃度梯度，即MS-222 10、25、40 mg/L和苯唑卡因 5.0、12.5、20.0 mg/L，每組3個(gè)重復(fù)組，并設(shè)空白對照組。實(shí)驗(yàn)在70 L半透明塑料桶中完成，每桶裝水50 L，放魚10尾，將魚浸浴6 h。實(shí)驗(yàn)用水為充分曝氣的自來水，水溫30.7～32.3 ℃。實(shí)驗(yàn)期間不間斷微充氣，保持溶氧在9.0 mg/L以上。由于苯唑卡因不易溶于水，易溶于乙醇，配制時(shí)加入少量乙醇助溶，對照組中也相應(yīng)添加等量乙醇。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每桶隨機(jī)取魚3尾尾靜脈采血，用HITACHI7020型全自動(dòng)生化分析儀測定各血液指標(biāo)。

1.3數(shù)據(jù)處理

用SPSS 15.0進(jìn)行One-Way ANOVA分析，并采用LSD法對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。相關(guān)性分析采用Excel 2010軟件Correl函數(shù)完成。

2　結(jié) 果

2.1麻醉處理后羅非魚血清離子水平

兩種麻醉劑處理后，紅細(xì)胞數(shù)及血清中K+、Na+、Cl-、Ca2+等4種無機(jī)離子濃度見表1、表2。

表1　MS-222麻醉后羅非魚的血液指標(biāo)Table 1　Inorganic ions and erythrocyte amount of Tilapia anaesthetized by MS-222 at different concentrations

表2　苯唑卡因麻醉后羅非魚的血液指標(biāo)Table 2　Inorganic ions and erythrocyte amount of Tilapia anaesthetized by benzocaine at different concentrations

表1中，經(jīng)MS-222處理后，隨麻醉濃度升高，血清中K+濃度呈持續(xù)下降趨勢，Na+濃度保持相對穩(wěn)定，Cl-濃度逐步升高，Ca2+濃度呈現(xiàn)出峰谷式波動(dòng)。

而羅非魚經(jīng)苯唑卡因處理后，隨麻醉濃度的升高，血清中K+濃度呈峰谷式波動(dòng)，Na+濃度亦保持相對穩(wěn)定，Cl-濃度呈現(xiàn)小幅波動(dòng)，Ca2+濃度基本呈下降趨勢。

2.2麻醉后羅非魚血清無機(jī)離子與紅細(xì)胞數(shù)間的相關(guān)性

紅細(xì)胞數(shù)與4種無機(jī)離子濃度之間的相關(guān)系數(shù)結(jié)果如表3。由表3可見，MS-222處理后，4種離子與紅細(xì)胞數(shù)目相關(guān)系數(shù)按絕對值大小排列依次為Cl-（0.911 6）、K+（-0.551 9）、Na+（0.337 5）、Ca2+（0.208 9），表明紅細(xì)胞數(shù)目升高與血清中Cl-濃度增加呈較高的正相關(guān)關(guān)系，而與其他3種離子濃度變化的相關(guān)性較低。經(jīng)苯唑卡因處理后，離子濃度與紅細(xì)胞數(shù)目之間相關(guān)系數(shù)按絕對值大小排列依次為Ca2+（0.970 1）、Na+（0.315 2）、Cl-（0.265 3）、K+（-0.049 9），表明紅細(xì)胞數(shù)目減少與血清中Ca2+濃度降低之間呈現(xiàn)較高的正相關(guān)關(guān)系，而與其他3種離子濃度變化的相關(guān)性較小或者基本無關(guān)。

表3　麻醉后羅非魚的紅細(xì)胞數(shù)目與血清無機(jī)離子濃度的相關(guān)系數(shù)Table 2　Correlation coefficient between erythrocyte amount and inorganic ions in serum of anaesthetized Tilapia

4種無機(jī)離子之間的相關(guān)系數(shù)結(jié)果如表4。由表4可見，血清中4種無機(jī)離子的相關(guān)性差異較大。兩種麻醉劑刺激條件下的K+-Na+之間相關(guān)性均最高，其次是K+-Cl-和Na+-Cl-，而K+-Ca2+、Na+-Ca2+和Cl--Ca2+等離子之間的相關(guān)性較低。

表4　麻醉后羅非魚血清中4種無機(jī)離子濃度之間的相關(guān)系數(shù)Table 4　Correlation coefficient between inorganic ions in serum of anaesthetized Tilapia

3　討 論

3.1麻醉劑對血清電解質(zhì)水平的影響

硬骨魚類血清中Cl-、Na+、Ca2+、K+的正常范圍分別為100～180 mmol/L、130～200 mmol/L、5 mmol/L以下、15 mmol/L[23]，本實(shí)驗(yàn)測得值均處于上述范圍之內(nèi)，表明所用的兩種麻醉劑濃度均可保障羅非魚正常存活。

經(jīng)20 mg/L苯唑卡因麻醉處理后，羅非魚血清中Ca2+濃度顯著下降，與美洲鰣的反應(yīng)一致[25]；Na+、Cl-濃度也有所降低，但不如美洲鰣顯著；相比之下，羅非魚血清中K+濃度變化較美洲鰣更為敏感，這可能與物種及處理時(shí)間差異有關(guān)。

3.2血清電解質(zhì)與紅細(xì)胞數(shù)目的相關(guān)性

羅非魚經(jīng)苯唑卡因麻醉后，紅細(xì)胞數(shù)目明顯減少，同時(shí)血清中Ca2+濃度隨之降低，而且二者之間存在極高的相關(guān)性。這說明，紅細(xì)胞的死亡過程伴隨發(fā)生了Ca2+內(nèi)流。研究表明，胞質(zhì) Ca2+濃度增高在哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞的凋亡過程中起核心作用[27]。Ca2+可進(jìn)一步激活鈣蛋白酶（calpain）、翻轉(zhuǎn)酶（scramblase）、蛋白酶、Ca2+依賴性K+通道等，從而觸發(fā)一系列的信號分子級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞凋亡[27]。由此推測，苯唑卡因?qū)е铝_非魚紅細(xì)胞數(shù)目減少可能是基于細(xì)胞凋亡的機(jī)制，并且主要是由 Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致的，這需要進(jìn)一步研究凋亡小體是否形成，以及研究Ca2+通道上相關(guān)蛋白激酶活性等來證實(shí)。

羅非魚經(jīng)MS-222處理后，紅細(xì)胞數(shù)升高與血清中Cl-濃度升高的相關(guān)性極高，表明紅細(xì)胞數(shù)目升高的同時(shí)發(fā)生了Cl-外流。由此可見，兩種麻醉劑對羅非魚紅細(xì)胞數(shù)的影響趨勢相反，與紅細(xì)胞數(shù)變化相關(guān)的血清離子亦不相同，數(shù)目升高主要與Cl-濃度變化相關(guān)，降低則主要與Ca2+濃度變化相關(guān)。這暗示，兩種麻醉劑雖均是p-氨基苯甲酸的衍生物[28]，但對羅非魚紅細(xì)胞數(shù)目的影響機(jī)制是不同的。

通常情況下，紅細(xì)胞膜兩側(cè)Cl-濃度保持內(nèi)低外高狀態(tài)，經(jīng)MS-222處理后，血清中Cl-濃度升高，表明紅細(xì)胞內(nèi)氯離子發(fā)生逆濃度梯度外流。Cl-同其他無機(jī)離子一樣，其跨膜逆濃度梯度流動(dòng)主要由相應(yīng)的離子通道協(xié)助完成[29]。對哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、心肌細(xì)胞的研究表明，Cl-通道具有抗細(xì)胞凋亡的功能，對谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[30]。但是尚未見關(guān)于Cl-通道在紅細(xì)胞凋亡調(diào)控中作用的報(bào)道，本研究中，Cl-外流的同時(shí)，紅細(xì)胞數(shù)目也相應(yīng)增加，表明Cl-通道可保護(hù)紅細(xì)胞免于死亡。

血清中K+-Na+之間的濃度呈較高的負(fù)相關(guān)性，說明二者的濃度變化是互逆進(jìn)行的，該過程主要是由Na+-K+泵（或Na+-K+ATP酶）主導(dǎo)完成。雖然該過程與紅細(xì)胞數(shù)目變化的相關(guān)性不高，但對于維持細(xì)胞滲透性和靜息電位是必需的[31]。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Effects of MS-222 and Benzocaine on Electrolyte Levels of Oreochromis niloticus and Its Correlation with Content of Erythrocyte

TANG Bao-gui, YANG Si-kai, ZHEN Su-bi, NI Fu-rong, ZHOU Xing-xing, XU Yue-rong, XIE Wei-ying
（Fisheries College of Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China）

Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) with body weight of (6.05 ± 1.71) g were exposed to MS-222 and benzocaine for 6 hours in 3 concentration gradients, then blood from caudal vein was abstracted, and variation of electrolyte (K+, Na+, Cl-and Ca2+) levels and its correlation with the content of erythrocytewas analyzed. The results showed that: 1) with the increase of MS-222 concentration, the level of K+in serum decreased continuously, and Na+concentration remained relatively stable, and Cl-concentration increased gradually, and Ca2+concentration fluctuated, and absolute value order of correlation coefficients between inorganic ion concentration and erythrocyte amount was Cl-（0.911 6）, K+（-0.551 9）, Na+（0.337 5）and Ca2+（0.208 9）, demonstrating a simultaneity of Cl-outflow and increasing of the amount of erythrocyte; 2) with the increase of benzocaine concentration, there was a “V” type fluctuation in serum K+concentration, while Na+concentrations remained relatively stable, and Cl-concentration showed a slight fluctuation, and Ca2+concentration was in a down channel, and order of absolute value of correlation coefficients between inorganic ion concentration and erythrocyte amount was Ca2+(0.970 1), Na+(0.315 2), Cl-(0.265 3) and K+(-0.049 9), demonstrating a simultaneity of erythrocyte amount decrease and inflow of Ca2+; 3) treated with either anesthetic, the order of absolute value of correlation coefficients among concentrations of the four inorganic ions were similar, and the highest was K+-Na+, then K+-Cl-and Na+-Cl-.

Oreochromis niloticus; anaesthesia; MS-222; benzocaine; inorganic ions; erythrocyte

Q175

A

1673-9159（2015）06-0025-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2015.06.005

2015-06-30

廣東海洋大學(xué)基金項(xiàng)目“麻醉劑對卵形鯧鯵的生理效應(yīng)及應(yīng)用研究”；湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目“幾種麻醉劑對卵形鯧鲹的麻醉及應(yīng)用研究”[湛科（2009）66]；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目“現(xiàn)代漁業(yè)專業(yè)鎮(zhèn)產(chǎn)學(xué)研創(chuàng)新聯(lián)盟建設(shè)”[2010B080201003]

湯保貴（1975－），男，博士，副教授；研究方向?yàn)轸~類增養(yǎng)殖學(xué)。E-mail：tangbg@gdou.edu.cn