鄭錦慶，王小寧，岳　杰，馬　驛，巨向紅，林紅英，陳進(jìn)軍

（廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東　湛江　524088）

飛機(jī)草總黃酮體外抑菌活性與體內(nèi)抗大腸埃希菌感染效果

鄭錦慶，王小寧，岳杰，馬驛，巨向紅，林紅英，陳進(jìn)軍

（廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江524088）

提取飛機(jī)草（Eupatorium odoratum Linn.）總黃酮，從抑菌圈、最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）等方面探討飛機(jī)草總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、雞白痢沙門(mén)氏菌（Salmonella pullorum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸埃希菌（Escherichia coli）的體外抑菌活性；經(jīng)腹腔注射大腸埃希菌感染小鼠后，灌胃給予飛機(jī)草總黃酮，觀(guān)察供試小鼠腹瀉率，測(cè)定小鼠糞便大腸埃希菌數(shù)及血清抗體水平（IgM、IgA和IgG），評(píng)價(jià)飛機(jī)草總黃酮的體內(nèi)抗感染作用。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌對(duì)飛機(jī)草總黃酮最為敏感，其抑菌圈直徑為19.50 mm，MIC為0.015 6 g/mL，MBC為0.031 3 g/mL；160 mg/kg的飛機(jī)草總黃酮可降低小鼠腹瀉率和糞便大腸埃希菌數(shù)（P < 0.01），提高血清IgA（P < 0.01）和IgG含量（P < 0.05）。飛機(jī)草總黃酮具有體內(nèi)、體外抗菌作用。

飛機(jī)草；總黃酮；體外抑菌；體內(nèi)抗感染

飛機(jī)草（Eupatorium odoratum Linn.）別名香澤蘭，為菊科澤蘭屬多年生草本植物，原產(chǎn)中美洲，1934年在我國(guó)云南南部發(fā)現(xiàn)。飛機(jī)草作為外來(lái)物種，對(duì)自然環(huán)境危害嚴(yán)重，目前已入侵我國(guó)南方大部分地區(qū)，是一種具有競(jìng)爭(zhēng)性的有害物種。迄今從飛機(jī)草中分離、鑒定出的化學(xué)成分以黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、揮發(fā)油和植物甾醇類(lèi)為主，其中黃酮類(lèi)化合物含量尤為豐富，全草總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)2.07%，無(wú)水乙醇浸膏中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)12.57%[1]。飛機(jī)草具有抑菌、消炎、解毒、促進(jìn)傷口愈合等功效[2-4]，且其多種藥效證明與其所含黃酮類(lèi)化合物有關(guān)[5]。對(duì)飛機(jī)草進(jìn)行獸醫(yī)藥效學(xué)研究是將其“變害為寶”的有益嘗試。本研究制備飛機(jī)草總黃酮，探討其體外抑菌活性及體內(nèi)抗大腸埃希菌感染效果，為飛機(jī)草總黃酮提取物用于畜禽腹瀉控制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）（ATCC 25923）、雞白痢沙門(mén)氏菌（Salmonella pullorum）（ATCC14028）、大腸埃希菌（Escherichia coli）（CMCC44752）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]由廣東海洋大學(xué)獸醫(yī)微生物教研室提供。LB營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂及麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2動(dòng)物

昆明種清潔級(jí)小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量20 ～ 23 g。

1.3主要儀器與試劑

主要儀器有生化培養(yǎng)箱（LRH-150B，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）、醫(yī)用凈化工作臺(tái)（YJ-875DA，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、循環(huán)水多用真空泵（SHZ-Ⅱ，河南鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng)）、酶標(biāo)儀（MK3型，美國(guó)Thermo公司）等。ELISA試劑盒購(gòu)自上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司，其他試劑均為分析純。

1.4細(xì)菌懸液制備

將菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)16 h，挑取單個(gè)菌落接種至肉湯培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)16 h后，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，用肉湯稀釋至107～ 109cfu/mL備用。

1.5飛機(jī)草總黃酮制備

將采自廣東湛江湖光巖的飛機(jī)草陰干，粉碎，過(guò)孔徑150 μm篩，于4 ℃條件下保存。參考楊逄建等方法[1]，以總黃酮為提取目標(biāo)物，取飛機(jī)草粉10 g，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀梨型蒸發(fā)器中，加入500 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，浸泡24 h后將其置于超聲波清洗器中，以頻率20 kHz提取30 min后將提取液安裝到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上在70℃下減壓蒸發(fā)進(jìn)行提取4 h，同時(shí)打開(kāi)冷凝閥門(mén)回收乙醇。提取液冷卻，過(guò)濾，得飛機(jī)草黃酮化合物提取液。將飛機(jī)草總黃酮提取液用10倍體積的石油醚萃取，除去葉綠素，再用乙酸乙酯萃取純化，揮發(fā)去乙酸乙酯，得純化的總黃酮浸膏，密封，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩＝?jīng)定性檢測(cè)[6]，該提取物中黃酮類(lèi)化合物顯色反應(yīng)為強(qiáng)陽(yáng)性，而其他生物活性成分如生物堿等均為陰性。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用分光光度法[7]定量測(cè)得該提取物含總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.84%。

1.6飛機(jī)草總黃酮體外抑菌試驗(yàn)

抑菌圈測(cè)定：采用打孔法測(cè)定抑菌圈直徑[8]。

最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定：采用試管倍比稀釋法，每個(gè)菌種3個(gè)重復(fù)。

最小殺菌濃度（MBC）測(cè)定：將上述培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，接種于普通瓊脂平板上，培養(yǎng)8～12 h后觀(guān)察，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度即為該藥物的最小殺菌濃度（MBC）[9]。

1.7飛機(jī)草總黃酮體內(nèi)抗感染試驗(yàn)

將90只試驗(yàn)小鼠分為空白對(duì)照組，飛機(jī)草總黃酮高、中、低劑量組，自愈組等5個(gè)組，每組18只小鼠。高、中、低劑量組（160、40、10 mg/kg）：小鼠腹腔注射約3×108個(gè)大腸埃希菌后3 h開(kāi)始給高、中、低劑量組小鼠灌胃給予不同劑量的飛機(jī)草黃酮，每天1次；自愈組小鼠只用大腸埃希菌腹腔注射感染，不作任何處理；空白對(duì)照組小鼠用生理鹽水代替飛機(jī)草總黃酮和大腸埃希菌懸液。每天觀(guān)察糞便，計(jì)算腹瀉率，于感染大腸埃希菌后1、4、7 d無(wú)菌采集小鼠糞便，對(duì)大腸埃希菌計(jì)數(shù)，并采集小鼠血清，用ELISA法測(cè)定血清抗體IgM、IgA、IgG含量。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件中的ANOVA程序進(jìn)行方差分析，多重比較用LSD法，P < 0.05為顯著水平，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

2　結(jié)果與分析

2.1供試細(xì)菌對(duì)飛機(jī)草總黃酮的藥物敏感性

飛機(jī)草總黃酮對(duì)4種供試細(xì)菌的抑菌圈均大于10 mm，達(dá)中度敏感以上。其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)19.50 mm；對(duì)大腸埃希菌的抑菌活性最弱，抑菌圈直徑為11.00 mm，達(dá)中度敏感（表1）。

表1　飛機(jī)草總黃酮（0.5 g/mL）對(duì)4種細(xì)菌的抑菌活性Table 1　Bacteriostatic activity of flavonoids ( 0.5 g/mL ) from Eupatorium odoratum against 4 strains of bacteria

2.2飛機(jī)草總黃酮對(duì)供試細(xì)菌的MIC、MBC

飛機(jī)草總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC、MBC最低，分別為0.015 6、0.031 3 g/mL，說(shuō)明飛機(jī)草總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的體外抑菌效果（表2）。

表2　飛機(jī)草總黃酮對(duì)4種細(xì)菌MIC、MBC值Table 2　MIC and MBC of flavonoids from Eupatorium odoratum against four strains of bacteria　　g/mL

2.3飛機(jī)草總黃酮對(duì)小鼠腹瀉率的影響

由圖1可見(jiàn)，感染大腸埃希菌1 d，除空白對(duì)照組，其他各組供試小鼠的腹瀉率均為100%；攻毒2、3、4 d時(shí)，高劑量組腹瀉率均為最低，分別為58.33%、25%、8.33%；攻毒5 d后各組腹瀉率為0?？梢?jiàn)一定劑量的飛機(jī)草總黃酮可有效降低大腸埃希菌感染小鼠的腹瀉率。

2.4飛機(jī)草總黃酮對(duì)小鼠糞便大腸埃希菌數(shù)的影響

由表3可知，攻毒1 d后，各處理組糞便大腸埃希菌數(shù)高于對(duì)照組，高劑量組低于中、低劑量組及自愈組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。攻毒4 d時(shí)，各處理組大腸埃希菌數(shù)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），高劑量組低于中、低劑量組及自愈組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。攻毒7 d后，高劑量組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），中、低劑量組及自愈組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。由此可見(jiàn)，飛機(jī)草總黃酮對(duì)小鼠腸道內(nèi)大腸埃希菌具有一定的抑菌作用，高劑量總黃酮抑菌效果最佳。

圖1　飛機(jī)草總黃酮對(duì)小鼠腹瀉率的影響Fig. 1　Effect of flavnoids from Eupatorium odoratum on ratio of diarrhea in rat

表3　飛機(jī)草總黃酮對(duì)小鼠糞便大腸埃希菌數(shù)的影響Table 3　Effect of flavonoids from Eupatorium odoratum on number of Escherichia coli　　　　　　　107cfu/g

2.5飛機(jī)草總黃酮對(duì)小鼠血清抗體水平的影響

由表4可知，攻毒1 d時(shí)，各組間IgM含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。攻毒4 d時(shí)，各處理組IgM含量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），但處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。攻毒7 d后，各組間IgM含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。由此可見(jiàn)，一定劑量的飛機(jī)草總黃酮可提升小鼠血清IgM水平，但持續(xù)時(shí)間小于7 d。

由表4可知，攻毒1 d，各組間IgA含量與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。攻毒4 d，與對(duì)照組相比，處理組IgA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），但處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。攻毒7 d后，處理組IgA含量稍有下降，但仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），高劑量組高于中、低劑量組及自愈組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。由此可見(jiàn)，一定劑量的飛機(jī)草總黃酮可提升小鼠血清IgA水平，持續(xù)時(shí)間大于7 d，高劑量組效果更佳。

由表4可知，攻毒1 d后，處理組IgG含量與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。攻毒4 d后，各處理組IgG含量升高，高、中劑量組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），低劑量組及自愈組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），高劑量組高于低劑量組及自愈組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。攻毒7 d后，各處理組IgG含量升高，高劑量組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），中、低劑量組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；高劑量組IgG含量高于其他處理組，與中、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），與自愈組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。由此可見(jiàn)，一定劑量的飛機(jī)草總黃酮可提升小鼠血清IgG水平，持續(xù)時(shí)間大于7 d，高劑量組效果最佳。

表4　飛機(jī)草總黃酮對(duì)小鼠血清IgM、IgA和IgG的影響Table 4　Effect of flavonoids from Eupatorium odoratum on number of IgM, IgA and IgG in serum of mice　ng/mL

3　討 論

3.1飛機(jī)草總黃酮的體外抑菌作用

本研究發(fā)現(xiàn)，飛機(jī)草總黃酮對(duì)4種供試細(xì)菌的體外抑菌效果均達(dá)中度敏感以上。其中，金黃色葡萄球菌對(duì)飛機(jī)草總黃酮的敏感性明顯高于雞白痢沙門(mén)氏菌和大腸埃希菌。文獻(xiàn)[10-11]表明，黃酮類(lèi)化合物可破壞細(xì)胞膜的功能，抑制細(xì)菌的核酸合成及能量代謝。何夢(mèng)影[12]通過(guò)蛋白滲漏和透射電鏡試驗(yàn)認(rèn)為，損傷細(xì)菌細(xì)胞膜是黃酮的主要抑菌機(jī)制之一。Yao等[13]發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)化合物川陳皮素和橘皮素處理銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和熒光假單胞菌（P. fluoerncnet）后，在電鏡下觀(guān)察可發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細(xì)菌結(jié)構(gòu)被破壞。因此推測(cè)，本研究的飛機(jī)草總黃酮可能具有損傷細(xì)菌細(xì)胞膜的作用。

3.2飛機(jī)草總黃酮的體內(nèi)抗菌作用

已有研究表明，黃酮對(duì)非特異性及特異性免疫均有一定的調(diào)節(jié)作用。付明哲等[14]研究表明，泡桐（Paulownia）花黃酮可顯著提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬百分率，提高實(shí)驗(yàn)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。張?zhí)K倩[15]通過(guò)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，泡桐花黃酮可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞免疫功能。鄭艷[16]在日糧中添加青刺果（Prinsepia utilis）總黃酮，發(fā)現(xiàn)其可顯著提高雛雞（Gallus domestiaus）血清中IgG和lgM含量，對(duì)IgA的升高也有促進(jìn)作用。IgM是機(jī)體初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，是機(jī)體抗感染的“先頭部隊(duì)”[17]；IgA可在機(jī)體黏膜局部抗感染免疫中發(fā)揮重要作用[18-19]；IgG則是血清中主要的抗體成分，具有抗菌抗病毒的作用，可在機(jī)體免疫中起保護(hù)作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，飛機(jī)草總黃酮對(duì)IgM的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但是高劑量飛機(jī)草總黃酮可提高IgA（P < 0.01）和IgG含量（P < 0.05）。小鼠腹腔注射大腸桿菌可造成腸道屏障功能的損傷，腸道微生物平衡紊亂，致病菌在腸道大量增生。高水平的IgA和IgG可有效抵抗細(xì)菌感染。本研究中，高劑量總黃酮可有效降低小鼠腹瀉率及糞便大腸桿菌數(shù)，說(shuō)明飛機(jī)草總黃酮通過(guò)提升機(jī)體體液免疫能力而控制腹瀉的發(fā)生，而小鼠糞便大腸桿菌數(shù)的減少可能還與飛機(jī)草總黃酮在腸道內(nèi)直接抑制致病菌的增值有關(guān)。

4　結(jié) 論

飛機(jī)草總黃酮對(duì)受試的4種細(xì)菌均有良好的抑菌活性，小鼠通過(guò)灌胃黃酮可提高體液免疫?？梢?jiàn)飛機(jī)草總黃酮具有體內(nèi)、外抗菌作用，可降低大腸桿菌性腹瀉率，將飛機(jī)草作為抗腹瀉中草藥開(kāi)發(fā)利用具有良好的應(yīng)用前景和環(huán)保價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

In vitro Antibacterial Activity and in vivo Fighting Escherichia coli Infection of Total Flavonoids from Eupatorium odoratum Linn.

ZHENG Jin-qing, WANG Xiao-ning, YUE Jie, MA Yi, JU Xiang-hong, LIN Hong-ying, CHEN Jin-jun
(Agricultural College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

The flavonoids were extracted from Eupatorium odoratum Linn. and the in vitro antibacterial activities of the flavonoids extract were examined by examining the zone of inhibition, minimal inhibition concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) against Staphylococcus aureus, Salmonella pullorum, Bacillus subtilis and Escherichia coli. A range of mice were intraperitoneally infected with Escherichia coli and were orally given the flavonoids extract to evaluate the in vivo anti-infection to diarrhea, the number of E. coli in feces and IgM, IgA and IgG in serum of the mice. The results showed that the Staphylococcus aureus responsed most sensitively to the flavonoids, with in vitro inhibition zone diameter of 19.50 mm, along with the MIC of 0.015 6 g/mL and the MBC of 0.031 3 g/mL. It was also found that 160 mg/kg of the flavonoids extract reduced the rate of diarrhea and the fecal coliform count (P < 0.01) and enhanced serum IgA (P < 0.01) and IgG (P < 0.05) in the mice. It was concluded that Eupatorium odoratum flavonoids really had antibacterial effects both in vitro and in vivo.

Eupatorium odoratum Linn.; total flavonoids; antibacterial effect in vitro; anti-infection in vivo

S853.74

A

1673-9159（2015）06-0053-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2015.06.010

2015-06-30

廣東省湛江市財(cái)政資金科技專(zhuān)項(xiàng)競(jìng)爭(zhēng)性分配項(xiàng)目“飛機(jī)草作為抗菌飼料添加劑資源的開(kāi)發(fā)利用研究”(2013A302-7)

鄭錦慶（1988－），男，在讀碩士生，主要從事動(dòng)物健康養(yǎng)殖研究，E-mail：417979942@qq.com

林紅英（1965－），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事動(dòng)物藥理和毒理學(xué)研究，E-mail：gdoulinhongying@sina.com；陳進(jìn)軍（1967－），男，博士，教授，主要從事動(dòng)物藥理和毒理學(xué)研究，E-mail：jjchen777@aliyun.com