常海霞，石燕，王輝，黃小琴，李瑞平，包中宇，涂宗財(cái)，，*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330022）

超聲波對草魚肌肉肌原纖維蛋白溶液理化特性的影響

常海霞1，石燕1，王輝1，黃小琴2，李瑞平1，包中宇1，涂宗財(cái)1，2，*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330022）

采用超聲波技術(shù)對草魚肌原纖維蛋白進(jìn)行處理，通過分析處理前后肌原纖維蛋白粒度、表面疏水性、巰基含量及分子質(zhì)量等結(jié)構(gòu)信息的變化，研究超聲波對草魚肌肉肌原纖維蛋白溶液理化特性的影響。結(jié)果表明：超聲波處理可使草魚肌原纖維蛋白顆粒分布更加均勻，肌原纖維蛋白顆粒粒徑、熱聚集程度、內(nèi)源熒光強(qiáng)度及巰基含量降低，且隨著處理時間的增加，降低的幅度增加，肌原纖維蛋白顆粒平均粒徑最小可達(dá)270.3nm。處理后的肌原纖維蛋白表面疏水性增加，分子質(zhì)量無明顯變化。這說明超聲波可誘導(dǎo)草魚肌原纖維蛋白分子展開，使疏水基團(tuán)等暴露，高級結(jié)構(gòu)受到破壞，蛋白顆粒發(fā)生解聚集，但對肌原纖維蛋白一級結(jié)構(gòu)無影響。

超聲波；肌原纖維蛋白；粒度；熱聚集；巰基；分子質(zhì)量

草魚是著名的“四大家魚”之一，其肉質(zhì)肥嫩，味鮮美，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，最高可達(dá)26%［1］。草魚肌肉蛋白中主要含肌原纖維蛋白、肌漿蛋白和基質(zhì)蛋白，其中肌原纖維蛋白約占總蛋白的60%～70%［2］，是草魚肌肉蛋白的主要成分。肌原纖維蛋白是鹽溶性蛋白，具有凝膠性、持水性、乳化性等優(yōu)良性質(zhì)，不僅可作為功能性蛋白成分廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，而且是魚糜制品的功能成分，其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)直接影響魚糜制品的形成，進(jìn)而影響魚肉制品的品質(zhì)［3］。但草魚肌原纖維蛋白存在凝膠強(qiáng)度差、易發(fā)生冷凍變性等缺陷［4］，因此有必要對其進(jìn)行改性。目前的研究主要集中在pH值、提取方法以及添加糖、卡拉膠、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）等化學(xué)改性對其功能性質(zhì)的影響。Li Xingke等［5］研究發(fā)現(xiàn)，用脫乙酰度為77.3%的殼聚糖修飾鰱魚肌原纖維蛋白具有很好的改性效果；Chen Hongsheng等［6］研究發(fā)現(xiàn)，冷凍保護(hù)劑的加入使鯉魚魚糜肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性、凝膠性得到提高。但上述研究具有低效率、耗時、耗能、成本高等缺點(diǎn)。

超聲波對食品中生物大分子的改性具有較好的效果，其通過機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)作用于接觸它的物質(zhì)，使底物的物理、化學(xué)反應(yīng)變得快速、均勻［7-8］，具有效率高、成本低、操作簡單、污染小等優(yōu)點(diǎn)，因此，在食品加工中的應(yīng)用備受關(guān)注。張崟等［9］研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理提高了魚糜的凝膠強(qiáng)度、黏性、彈性、恢復(fù)性等；Julian McClements等［10］研究表明，超聲波可以促進(jìn)肌原纖維蛋白的釋放，進(jìn)而提高了肉制品的持水性、嫩度、黏結(jié)性等理化性質(zhì)。然而，超聲波對肌原纖維蛋白理化特性的影響鮮有報(bào)道。

由于蛋白質(zhì)的理化特性與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)有很大的關(guān)系，其理化特性的改變可以引起蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的改變。因此本實(shí)驗(yàn)以草魚肌原纖維蛋白為原料，研究超聲波處理對肌原纖維蛋白理化特性的影響，以期為超聲波改性肌原纖維蛋白提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

草魚，購于南昌市青山湖區(qū)天虹超市。

十二磺基硫酸鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨等（分析純）阿拉丁試劑有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-aniline-1-naphthalene sulfonic acid，ANS）、β-巰基乙醇、25～170kD Marker美國Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司；HR2094飛利浦?jǐn)嚢铏C(jī)飛利浦家庭電器有限公司；ML104電子天平、DZG-6021P pH計(jì)梅特勒-托利多有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；JY98-ⅢDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；F-7000熒光光譜儀日本日立公司；Mini Protean Tetra MP4電泳儀美國伯樂公司；NICOMPTM380激光納米粒度測定儀美國Nicomp公司。

1.3方法

1.3.1肌原纖維蛋白的提取

參照Liu Qian等［11］的方法從草魚肌肉中提取肌原纖維蛋白。生鮮草魚去皮、骨、內(nèi)臟，所得魚肌肉用攪拌機(jī)打碎，魚糜加入4倍體積（m/V）的0.02mol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用攪拌機(jī)攪拌勻漿60s，肌肉勻漿液于4℃、2000×g離心15min，取其沉淀，用上述磷酸鹽緩沖溶液（4倍體積）在相同的攪拌和離心條件下洗滌3次以上，得到的沉淀再用4倍體積0.1mol/L的NaCl溶液在上述相同的條件下洗3次，最后一次離心前，用3層紗布過濾以除去肌肉勻漿液中的結(jié)締組織。得到的沉淀用0.02mol/L pH6.5含0.6mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液溶解，該溶液即為肌原纖維蛋白溶液，于4℃儲存?zhèn)溆?。肌原纖維蛋白的質(zhì)量濃度采用雙縮脲法進(jìn)行測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品［12］。

1.3.2肌原纖維蛋白的超聲波處理

將肌原纖維蛋白溶液稀釋至質(zhì)量濃度10mg/mL，取200mL該溶液于連有冷卻管套的雙層玻璃燒杯中，將燒杯置于超聲波細(xì)胞破碎儀中（超聲探頭為頻率20kHz，直徑15mm的鈦金屬探頭），設(shè)置超聲時間為0、3、6、9、12、20min（工作時間和間歇時間分別為1s和3s），超聲功率設(shè)為480W，冰水通過冷卻套管持續(xù)循環(huán)，控制樣品溫度為4～8℃，處理后的樣品于0～4℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆茫?3］。

1.3.3粒度的測定

參考Zhang Qiuting等［14］的方法，肌原纖維蛋白溶液用0.02mol/L pH6.5含0.6mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液稀釋2倍，采用NICOMP380/ZLS激光納米粒度測定儀對樣品的平均粒徑進(jìn)行測定。

1.3.4熱聚集程度的測定

在魚糜產(chǎn)品加工過程中，熱處理是塑造肌原纖維蛋白凝膠特性的重要手段，其主要作用來源于蛋白的熱聚集行為的變化。本實(shí)驗(yàn)參考Li Yanqing等［15］的方法，肌原纖維蛋白溶液用0.02mol/L pH6.5含0.6mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液稀釋至質(zhì)量濃度為1mg/mL，將稀釋后的樣品從30℃加熱到80℃，分別選擇加熱至30、40、50、60、70、80℃時測定樣品在600nm波長處的吸光度。

1.3.5總巰基含量的測定

參考Liu Qian等［11］的方法，肌原纖維蛋白溶液用0.02mol/L pH6.5含0.6mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液稀釋至2mg/mL，取1mL稀釋后的蛋白與8mL緩沖溶液（0.086mol/L Tris-HCl、0.09mol/L Gly、0.004mol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）、8mol/L尿素，pH8.0）混合，于8000×g離心15min。取4.5mL上清液于10mL離心管中，加入0.5mL Ellman’s試劑（0.01mol/L5，5’二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）），漩渦振蕩后，于412nm波長處測吸光度。

Ellman’s試劑的配制：0.198175g DTNB用50mmol/L Na2HPO4（pH7.0）配制成50mL溶液，于棕色瓶中，暗處低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6自由巰基含量的測定

取1mL2mg/mL的肌原纖維蛋白溶液于8mL緩沖溶液（0.086mol/L Tris-OH、0.09mol/L Gly、0.004mol/L EDTA、8mol/L尿素，pH8.0）中，于8000×g離心15min，取其上清液測定自由巰基的含量測定方法同總巰基含量的測定，自由巰基的含量按以下公式計(jì)算。

式中：A412nm和A532nm分別代表反應(yīng)溶液在412nm和532nm波長處的吸光度。

1.3.7內(nèi)源性熒光和表面疏水性的測定

蛋白溶液用樣品緩沖液稀釋至質(zhì)量濃度1mg/mL后，以280nm為激發(fā)波長測定肌漿蛋白溶液在300～400nm范圍內(nèi)的發(fā)射光譜，分析其內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化。

參照Chelh等［16］的方法。樣品溶液采用樣品緩沖溶液分別稀釋為質(zhì)量濃度0.5、1.0、1.5mg/mL。取50μL稀釋后的樣品于20mL、0.008mol/L ANS磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.0）中，混勻并定容至4mL。使用F-7000熒光分光光度計(jì)分析樣品的表面疏水性，激發(fā)波長為338nm，發(fā)射波長為496nm，掃描速率200nm/min，以未加熒光探針的相應(yīng)質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)溶液所測得的熒光強(qiáng)度作為空白。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）對熒光強(qiáng)度作圖，采用線性回歸分析進(jìn)行曲線擬合，直線的斜率即是蛋白質(zhì)的表面疏水性（H0）。

1.3.8分子質(zhì)量分析

參考Zhou Feibai等［17］的方法，電泳條件：5%濃縮膠，10%分離膠，4倍上樣緩沖液，上樣量8 μL，電流12mA，分離膠電壓24mA，Marker為低分子質(zhì)量（25～170kD）。用考馬斯亮藍(lán)G250染色45min后脫色，直至背景清晰。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果與分析

2.1超聲波對肌原纖維蛋白粒度的影響

蛋白質(zhì)的粒度是影響蛋白質(zhì)功能特性的因素之一［18］，也是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的宏觀表現(xiàn)。前期研究表明，超聲波處理可改變蛋白顆粒粒度。由圖1A可知，超聲波處理可明顯降低肌原纖維蛋白的平均粒徑，且隨著處理時間的延長，降低的程度增大，肌原纖維蛋白的平均粒徑由未處理的2211.4nm降低至處理20min的270.3nm?？赡苁怯捎诔暡ǖ穆暱栈饔每僧a(chǎn)生強(qiáng)烈的物理作用力，包括剪切力、震波和湍流，能有效使蛋白質(zhì)顆粒發(fā)生破碎，粒度下降。由圖1B可知，超聲波處理后肌原纖維蛋白溶液的平均粒徑降低，未經(jīng)超聲波處理的肌原纖維蛋白粒徑分布范圍為200～2300nm，而經(jīng)超聲波處理后的肌原纖維蛋白粒徑分布范圍變?yōu)?00～5000nm，這表明，超聲波處理可以顯著影響肌原纖維蛋白溶液的粒徑分布范圍，使得肌原纖維蛋白溶液的粒徑分布更集中，分布寬度變窄，即顆粒大小更加均勻。

圖1　超聲波處理對肌原纖維蛋白平均粒徑（AA）和粒度分布（BB）的影響Fig.1Effect of ultrasonic treatment on the mean part icle diameter（A）and particle distribution（B）of myofibrillar protein

2.2超聲波對肌原纖維蛋白熱聚集的影響

圖2超聲波處理對肌原纖維蛋白熱聚集的影響Fig.2Effect of ultrasonic treatment on the thermal aggregation of myofibrillar protein

肌原纖維蛋白熱變性聚集能反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化以及分子間相互作用，包括氫鍵、二硫鍵、肽鍵等之間的相互作用［19］。濁度是反映蛋白質(zhì)聚集程度的指標(biāo)，肌原纖維蛋白經(jīng)超聲波處理后在加熱過程中其濁度變化如圖2所示，超聲波處理可以明顯降低肌原纖維蛋白的濁度，且隨著處理時間的延長，降低的程度也增大。與原樣相比，經(jīng)超聲處理3、6、9、12、20min后，其加熱至80℃時的濁度分別降低了57.8%、66.8%、67.5%、75.0%、70.1%，可能的原因是超聲波對溶液體系的空化效應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的剪切力、震波、湍流等物理作用力［20］，蛋白顆粒發(fā)生了聚集，其熱變性聚集程度降低。一般情況下，隨著加熱溫度的升高，蛋白分子會發(fā)生變性，蛋白分子間會發(fā)生聚集，溫度越高，聚集程度越高，但經(jīng)超聲波處理后，樣品的濁度隨溫度增加而增加趨勢明顯變緩，說明超聲波處理削弱了加熱對肌原纖維蛋白分子的變性聚集作用。以上結(jié)果表明，超聲波對肌原纖維蛋白具有去聚集作用，能抑制蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的共價和非共價交聯(lián)。

2.3超聲波對肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光和表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)具有內(nèi)源熒光性，蛋白質(zhì)分子中色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）能發(fā)射熒光［21］，因此可以通過熒光光譜分析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化。草魚肌原纖維蛋白經(jīng)超聲波處理后其內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化如圖3A所示，處理前后肌原纖維蛋白分子的熒光最大發(fā)射波長未發(fā)生改變，均為280nm處，但隨著超聲時間的延長，其內(nèi)源熒光強(qiáng)度呈下降的趨勢。可能原因是超聲波處理使肌原纖維蛋白分子展開，使Trp和Tyr等發(fā)色團(tuán)暴露于溶劑中產(chǎn)生了溶劑猝滅作用，從而使熒光強(qiáng)度降低［22］。

表面疏水性是蛋白質(zhì)重要的結(jié)構(gòu)性質(zhì)之一，其能反映蛋白質(zhì)分子微觀構(gòu)象的變化［23］。蛋白質(zhì)表面疏水性主要通過測定蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸與ANS形成的結(jié)合物的熒光強(qiáng)度來表示。肌原纖維蛋白經(jīng)超聲波處理后其表面疏水性的變化如圖3B所示，隨著超聲時間的延長，表面疏水性呈明顯的上升趨勢，超聲處理20min時，樣品表面疏水性比未經(jīng)處理的樣品增加了3.8倍。可能的原因是超聲波產(chǎn)生的綜合作用促使蛋白質(zhì)分子展開，原來包埋在分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露至分子表面，這與內(nèi)源性熒光的結(jié)果一致。這說明超聲波處理對草魚肌原纖維蛋白分子高級結(jié)構(gòu)具有一定的破壞作用，蛋白的表面疏水性增加。

圖3超聲波處理對肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光（AA）和表面疏水性（BB）的影響Fig.3Effect of ultrasonic treatment on the intrinsic fluorescence intensity（A）a nd surface hydrophobicity（B）of myofibrillar protein

2.4超聲波對肌原纖維蛋白總巰基和自由巰基含量的影響

巰基基團(tuán)是蛋白質(zhì)中活性最強(qiáng)的官能團(tuán)之一，也是影響蛋白質(zhì)功能特性的重要因素。經(jīng)超聲波處理后，肌原纖維蛋白的總巰基和自由巰基含量的變化如圖4所示，超聲處理后溶液中肌原纖維蛋白的自由巰基和總巰基含量下降，且隨超聲時間變化的趨勢一致，即隨著超聲時間的延長，下降程度增加。經(jīng)超聲處理20min總巰基和自由巰基含量分別由未經(jīng)處理的55.711μmol/g pro和51.398μmol/g pro降低至31.912μmol/g pro和27.015μmol/g pro?？赡艿脑蚴浅暡ㄌ幚砜梢允沟鞍踪|(zhì)分子展開，巰基基團(tuán)暴露，同時，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)能使水解離為氫原子和高活性的羥自由基［24］，羥自由基會使肌原纖維蛋白的巰基含量減少［15］，巰基含量的減少是超聲促使肌原纖維蛋白分子展開與羥自由基產(chǎn)生的共同結(jié)果。

圖4超聲波處理對肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.4Effect of ultrasonic treatment on the content of sulfhydryl groups in myofibrillar protein

2.5超聲波處理對肌原纖維蛋白分子質(zhì)量的影響

肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白、肌動蛋白和原肌球蛋白，分子質(zhì)量分別約為480、43kD和33～36kD。肌球蛋白由2條分子質(zhì)量為220kD重鏈和4條分子質(zhì)量為10～27.5kD輕鏈組成。超聲波處理后的肌原纖維蛋白經(jīng)電泳分析，結(jié)果如圖5所示，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）和肌動蛋白（actin）譜帶比較明顯且較寬，說明肌原纖維蛋白的主要成分為肌球蛋白和肌動蛋白。與原樣相比，超聲波處理并沒有引起肌原纖維蛋白電泳譜帶大的變化，未出現(xiàn)蛋白降解片段或蛋白共價聚集產(chǎn)物，說明超聲波處理不會引起蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變化［25-26］。

圖5超聲波處理對肌原纖維蛋白分子質(zhì)量的影響Fig.5Effect of ultrasonic treatment on the molecular weight of myofibrillar protein

3　結(jié)論

超聲波技術(shù)是食品生物大分子物理改性方法之一，食品生物大分子經(jīng)超聲波處理后可引起分子理化特性的變化。草魚肌原纖維蛋白經(jīng)超聲波處理后，顆粒粒徑下降，顆粒大小分布更加均勻，平均粒徑由2211.4nm降低至270.3nm；超聲波對肌原纖維蛋白具有去聚集作用，熱聚集程度降低，在12min、80℃處理?xiàng)l件下，其濁度降低了75.0%；超聲處理后的草魚肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度及巰基含量降低，總巰基和自由巰基含量分別由55.711μmol/g pro和51.398μmol/g pro降低至31.912μmol/g pro和27.015μmol/g pro，表面疏水性增加了3.8倍，蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)受到破壞，分子質(zhì)量未受影響。因此，采用超聲波技術(shù)對肌原纖維蛋白進(jìn)行改性具有一定的效果。超聲波對草魚肌原纖維蛋白高級結(jié)構(gòu)的影響機(jī)理以及對草魚肌原纖維蛋白功能性質(zhì)的影響有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Ultrasonic Treatment on Physico-chemical Properties of Myofibrillar Protein from Grass Carp

CHANG Haixia1，SHI Yan1，WANG Hui1，HUANG Xiaoqin2，LI Ruiping1，BAO Zhongyu1，TU Zongcai1，2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang330047，China；2.College of Life Science，Jiangxi Normal University，Nanchang330022，China）

The physico-chemical pr operties of myofibrillar protein solution treated by ultrasonic were evaluated by particle diameter，surface hydrophobicity，sulfhydryl content and SDS-PAGE profile.After ultrasonic treatment，the particles of samples were distributed more uniformly.The mean particle diameter，thermal aggregation，fluorescence intensity and sulfhydryl content of myofibrillar protein decrease d with increasing ultrasonic treatment time.The minimum particle diameter of myofibrillar protein was270.3nm.The surface hydrophobicity of the protein increased，but the molecular weight showed no significant change.Therefore，myofibrillar protein could be unfolded and the hydrophobic groups were exposed by ultrasonic treatment；finally the high-order structure was destroyed and the aggregation was promoted although the primary structure was not changed.

ultrasonic treatment；myofibrillar protein；particle diameter；thermal aggregation；sulfhydryl groups；molecular weight

TS254.1

A

1002-6630（2015）05-0056-05

10.7506/spkx1002-6630-201505011

2014-06-30

江西省重大科技創(chuàng)新研究項(xiàng)目（20124ACB00600）；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（JXARS-02）

常海霞（1989—），女，碩士研究生，主要從事極端條件下食品蛋白質(zhì)營養(yǎng)與安全研究。

E-mail：hxchang_ncu@163.com

涂宗財(cái)（1965—），男，教授，博士，主要從事極端條件下食品蛋白質(zhì)營養(yǎng)與安全研究。E-mail：tuzc-mail@aliyun.com