古勇明　陳柏湘　韓林強(qiáng)　劉冰南　黎　潔

1.廣東省佛山市南海百容水產(chǎn)良種有限公司，廣東佛山528216；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070

YY超雄黃顙魚(yú)精子保存液和激活液的篩選及在生產(chǎn)上的應(yīng)用

古勇明1陳柏湘1韓林強(qiáng)1劉冰南1黎潔2

1.廣東省佛山市南海百容水產(chǎn)良種有限公司，廣東佛山528216；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070

分別以精子活力和受精率為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)5種精子保存液在不同稀釋倍數(shù)下保存超雄黃顙魚(yú)精子的效果及不同濃度NaCl激活液的應(yīng)用效果進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，B保存液效果最好，精子活力和壽命保持時(shí)間最長(zhǎng)，8倍稀釋液在4℃條件下，96h內(nèi)可保持80%以上的活力；低濃度NaCl溶液能延長(zhǎng)精子的壽命，在0.3% NaCl溶液中激活精子活力最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)篩選的超雄黃顙魚(yú)精子保存液和激活液在全雄黃顙魚(yú)生產(chǎn)中具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

YY超雄黃顙魚(yú)；精子；保存液；激活液；受精率

黃顙魚(yú)（Pelteobagrusfulvidraco）隸屬于鯰形目、鲿科、黃顙魚(yú)屬，俗稱(chēng)嘎魚(yú)、黃姑、黃蠟丁，是一種小型底層經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，肌間刺少，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，已成為我國(guó)名特優(yōu)水產(chǎn)品重點(diǎn)養(yǎng)殖對(duì)象之一，2013年全國(guó)黃顙魚(yú)總產(chǎn)量超過(guò)50萬(wàn)t[1]。

在相同養(yǎng)殖條件下，全雄黃顙魚(yú)的養(yǎng)殖效益顯著高于普通黃顙魚(yú)[2-3]，使得全雄黃顙魚(yú)苗種市場(chǎng)需求量不斷增加。全雄黃顙魚(yú)人工繁殖生產(chǎn)需殺超雄黃顙魚(yú)取精，剪碎研磨，再用精子保存液清洗和稀釋?zhuān)籼幚聿划?dāng)將會(huì)影響精子活力，造成受精率低下，同時(shí)造成YY超雄魚(yú)親本浪費(fèi)，增加生產(chǎn)成本。

有關(guān)黃顙魚(yú)等鲇形目魚(yú)類(lèi)精子保存液和激活液的研究已有報(bào)道[4-7]，但超雄黃顙魚(yú)（YY）與一般黃顙魚(yú)雄魚(yú)（XY）在遺傳基礎(chǔ)上存在本質(zhì)差異，兩者精子組成不同，保存液效果是否一致，目前還未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。

本研究初步探討了5種保存液及不同濃度激活液對(duì)超雄黃顙魚(yú)精子活力的影響，以篩選出效果最優(yōu)的保存液和激活液參數(shù)，并在人工繁殖生產(chǎn)中應(yīng)用，指導(dǎo)苗種生產(chǎn)。

1　材料與方法

1.1材料來(lái)源

YY超雄黃顙魚(yú)為佛山市南海百容水產(chǎn)良種有限公司研發(fā)育成，使用前利用分子標(biāo)記鑒定確認(rèn)。在繁殖季節(jié)，選取體表無(wú)傷、無(wú)病、個(gè)體健康、性成熟的YY超雄黃顙魚(yú)，體重為200～250g。精子保存容器為經(jīng)洗滌和高溫滅菌處理后的10mL可密封青霉素玻璃瓶。

1.2精子保存液的制備

根據(jù)魚(yú)類(lèi)精子保存的生理需要，參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-7]，配制了A～E共5種精子保存液，具體配方成分組成見(jiàn)表1。

1.3超雄黃顙魚(yú)精子采集

采用人工催產(chǎn)的方法進(jìn)行精子采集。催產(chǎn)激素及劑量為：LHRH-A24μg/kg，DOM1.0mg/kg，到達(dá)效應(yīng)時(shí)間時(shí)，先用干毛巾擦干魚(yú)身，然后剖腹取出乳白色的精巢，剔除血污等，置于吸水紙上吸去水分，在孔徑為0.150mm的干凈網(wǎng)布中擠出精子，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4精液的保存

使用定量移液槍將精液分別用保存液A～E進(jìn)行4、8倍稀釋?zhuān)４嫫恐糜诒洌?℃）保存，設(shè)置3個(gè)平行。

1.5精子活力觀察

用1mL微型注射器針尖挑取少量精液，放至事先滴好低滲溶液的計(jì)數(shù)板上，激活精子，在數(shù)碼顯微鏡下拍攝出精子在各種低滲溶液中的運(yùn)動(dòng)狀況。用精子激活后的活力（快速運(yùn)動(dòng)精子占總精子數(shù)的百分比）為指標(biāo)對(duì)保存效果進(jìn)行評(píng)價(jià)?！?++”表示100%精子快速運(yùn)動(dòng)；“++”表示80%精子快速運(yùn)動(dòng)；“+”表示50%精子快速運(yùn)動(dòng)；“+-”表示10%～30%精子快速運(yùn)動(dòng)；“-”表示少量精子在原地振動(dòng)或全部死亡。精子的激活率、強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)期、慢速運(yùn)動(dòng)期和壽命的觀察參照相關(guān)文獻(xiàn)[8]。

1.6人工授精受精率統(tǒng)計(jì)

每組各取卵子約500粒于培養(yǎng)皿中，分別加入0.1mL精液，并加入10mL水激活，迅速振蕩使卵子和精子充分結(jié)合并黏于培養(yǎng)皿底部后統(tǒng)一置于塑料大盆中，定期換水、充氣，保證溶氧。受精卵處于原腸中期時(shí)，在解剖鏡下抽樣觀察并計(jì)數(shù)受精卵，計(jì)算其受精率，受精率=（原腸中期卵數(shù)目/總卵數(shù)）×100%。每組設(shè)置3個(gè)平行。

1.7試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）不同保存液對(duì)超雄黃顙魚(yú)精子保存效果的影響。

在低溫（4℃）條件下，觀察5種精子保存液4、8倍稀釋保存的結(jié)果。前12h每隔2～4h觀察1次，以后12～24h時(shí)觀察1次，記錄結(jié)果。獲得超雄黃顙魚(yú)精子活力的時(shí)間變化規(guī)律，確定最優(yōu)保存液和最佳保存時(shí)間。

2）不同保存時(shí)間對(duì)人工授精效果的影響。

利用篩選的最優(yōu)保存液保存精液，評(píng)估不同保存時(shí)間的授精效果。選擇發(fā)育良好的雌魚(yú)3尾和超雄魚(yú)2尾，注射催產(chǎn)激素，2次注射，針距10h，第1針LHRH-A210μg/kg，第2針LHRH-A25μg/kg、 DOM2.0mg/kg和HCG1500IU/kg，效應(yīng)時(shí)間后擠卵，選擇卵質(zhì)良好、數(shù)量較多的同一尾雌魚(yú)卵用于實(shí)驗(yàn)。在培育皿中各取約500顆卵粒分別與不同保存時(shí)期保存的精液和新鮮精液授精，加水激活，然后放入塑料盆中孵化，統(tǒng)計(jì)受精率，每組設(shè)置3個(gè)平行。

3）不同低滲激活液對(duì)超雄黃顙魚(yú)精子活力的影響。

考察超雄黃顙魚(yú)精子在不同鹽度激活液中的激活情況，統(tǒng)計(jì)精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、慢速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和平均壽命，篩選出最佳的激活液濃度。

4）不同低滲激活液對(duì)人工授精效果的影響。

生產(chǎn)過(guò)程中選擇發(fā)育較好的雌魚(yú)，注射催產(chǎn)激素，效應(yīng)時(shí)間后，選擇卵質(zhì)良好的卵用于實(shí)驗(yàn)，干法授精，分別用不同濃度激活液（0.0%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）激活，統(tǒng)計(jì)受精率，每組設(shè)置3個(gè)平行。1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)在SSPP19.0軟件中整理并作多重比較分析，顯著水平為P=0.05。

表1　精子保存液配方組成情況

2　結(jié)果與分析

2.1不同保存液對(duì)超雄黃顙魚(yú)精子保存效果的影響

超雄黃顙魚(yú)精子在不同保存液中的保存效果見(jiàn)表2。低溫條件下（4℃），5種保存液4倍和8倍稀釋保存下的精液在前24h內(nèi)精子活力均很強(qiáng)，激活后幾乎100%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；24h后活力出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但不同保存液中的精子活力變化有所不同，不同稀釋倍數(shù)間也開(kāi)始出現(xiàn)差異。

1）保存液A：4倍稀釋保存中，24h后活力下降趨勢(shì)明顯，48～72h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；96h激活后僅約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；120h精子基本死亡。8倍稀釋保存中，保存48h后精子活力下降不明顯，激活后仍有接近100%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；72～120h活力下降明顯，激活后作快速運(yùn)動(dòng)的精子量從80%逐步降低到10%；144h精子基本死亡。

2）保存液B：4倍稀釋保存中，24h后活力下降趨勢(shì)明顯，48～72h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；96～120h激活后約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；144h精子仍有約10%的精子可以快速運(yùn)動(dòng)。8倍稀釋保存中，保存48h后精子活力下降不明顯，激活后仍有接近100%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；72～96h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；120～144h激活仍可觀察到約50%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)。

3）保存液C：4倍稀釋保存中，24h后精子活力下降，48～96h激活后超過(guò)80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；120h激活后僅約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；144h后僅有不到10%的精子可以快速運(yùn)動(dòng)。8倍稀釋保存中，24h后精子活力變化不大，48h仍可觀察到100%的精子快速運(yùn)動(dòng)，72～96h激活后超過(guò)80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；120h激活后僅有約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；144h觀察僅有不到10%的精子可以快速運(yùn)動(dòng)。

4）保存液D：4倍稀釋保存中，24h后活力下降趨勢(shì)明顯，48～72h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；96h激活后約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；120～144h僅有約10%～30%的精子可快速運(yùn)動(dòng)。8倍稀釋保存中，24h后精子活力下降較明顯，48～120 h激活后作快速運(yùn)動(dòng)的精子量從80%逐步降低至10%；144h精子基本死亡。

5）保存液E：4倍稀釋保存中，24h后活力下降趨勢(shì)明顯，48～72h激活后50%的精子在做快速運(yùn)動(dòng)；96h激活后僅有約20%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；120 h 精子基本死亡。8倍稀釋保存中，24h后活力下降趨勢(shì)明顯，48h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；72～96h激活后僅有約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；120h激活后僅有約10%~30%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；144h精子基本死亡。

表2　超雄黃顙魚(yú)精子在不同保存液中的保存效果（4℃）

6）原精：保存8h精子活力未見(jiàn)明顯降低，8h之后活力下降明顯，12h激活后80%左右精子作快速運(yùn)動(dòng)，24h激活后約50%精子作快速運(yùn)動(dòng)，48h觀察基本看不到快速運(yùn)動(dòng)的精子了。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明保存液B對(duì)超雄黃顙魚(yú)精液的保存效果相對(duì)較佳。稀釋倍數(shù)方面，除了保存液D的4倍稀釋效果略?xún)?yōu)于8倍稀釋外，其他保存液的結(jié)果均顯示8倍稀釋較4倍稀釋的效果好。綜合以上結(jié)果，篩選出保存液B的8倍稀釋作為超雄黃顙魚(yú)精液的保存液。

2.2不同保存時(shí)間對(duì)人工授精效果的影響

不同保存時(shí)間的精液人工授精的受精率見(jiàn)圖1。

從圖1可知，對(duì)照組的受精率始終保持在約90%的水平，且不同時(shí)間的差異較小。低溫條件下，保存液B的8倍稀釋保存精液在48h內(nèi)的受精率（84.5%～94.6%）與原精（85.3%～94.3%）相比差異極小，受精效果均較好。48～96h與原精相比，受精率呈現(xiàn)一定下降趨勢(shì)，120h后保存精液的受精率急劇下降，144h受精率降低至約60%。結(jié)果表明，保存液B的8倍稀釋保存精液最好在2～3d內(nèi)使用，保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，受精效果存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)使用前要求鏡檢精子的活力情況，該結(jié)果與觀察到的不同保存時(shí)間精液的精子活力結(jié)果基本吻合。

圖1　不同保存時(shí)間的精液人工授精的受精率

圖2　不同濃度NaCl激活液條件下人工授精的受精率

2.3不同低滲激活液對(duì)超雄黃顙魚(yú)精子活力的影響

超雄黃顙魚(yú)精液在不同濃度NaCl溶液中激活的情況見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示，低滲溶液能不同程度地提高超雄黃顙魚(yú)精子的活力與壽命。各試驗(yàn)組的精子強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著高于對(duì)照組，以0.2%濃度組和0.3%濃度組最高，分別為32.3±4.6、38.7±3.8s，相比對(duì)照組延長(zhǎng)了9～15s；精子慢速運(yùn)動(dòng)時(shí)間同樣以0.2%濃度組和0.3%濃度組最高，其次是0.4%濃度組，均顯著高于對(duì)照組。精子壽命以0.3%濃度組最高，0.4%和0.2%次之，同樣顯著高于對(duì)照組。

精子被激活數(shù)量的觀察結(jié)果顯示，隨著低滲激活液濃度增大激活比例呈下降趨勢(shì)，但0.0%~0.3%濃度組精子的激活率下降不明顯，均保持在90%以上，而0.4%～0.5%濃度組精子的激活率顯著下降，僅60%左右。

2.4不同低滲激活液對(duì)人工授精受精率的影響

不同低滲激活液激活條件下全雄黃顙魚(yú)人工授精受精率的結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖2。

結(jié)果表明不同低滲激活液條件下獲得的受精率存在差異（69.9%～77.1%），激活液在0.0%～0.3%的濃度范圍，受精率隨著濃度的升高而上升；在0.3%～0.5%的濃度范圍，受精率隨濃度的升高而下降，其中以0.3%濃度組的受精率最高，0.2%的次之，兩者顯著高于對(duì)照組。

表3　超雄黃顙魚(yú)精子在不同濃度低滲溶液中的活力1）

3　討論

3.1不同保存液及稀釋比例對(duì)超雄黃顙魚(yú)精液保存效果的影響

本研究考察了4℃條件下5種精子保存液保存超雄黃顙魚(yú)精液的效果，與對(duì)照組相比，5種保存液均可延長(zhǎng)YY超雄黃顙魚(yú)精液的保存時(shí)間。各保存液之間存在一定差異，保存液B的保存效果相對(duì)最佳，其次是D，再次是C、A、E。不同保存液間效果的差異與保存液的配方組成有關(guān)。精液的保存需要適當(dāng)?shù)臐B透壓、離子組成、pH、能量供給等一系列條件，保存液的組成越接近精漿的組成，保存時(shí)間就會(huì)越長(zhǎng)[9]。本實(shí)驗(yàn)中5種精子保存液均在相關(guān)研究中證實(shí)對(duì)精液短期低溫保存具有良好效果，但對(duì)于超雄黃顙魚(yú)精液的保存效果存在一定的差異。超雄黃顙魚(yú)精子在含葡萄糖溶液中的壽命較其他保存液中相對(duì)較長(zhǎng)，可能葡萄糖除提供適宜的滲透壓外，還起著額外的作用。這與蘇德學(xué)等[11]在黃顙魚(yú)精子保存中的研究結(jié)果類(lèi)似，推測(cè)黃顙魚(yú)精子具有利用細(xì)胞外源性葡萄糖的能力，以彌補(bǔ)在活動(dòng)過(guò)程中消耗的部分能量，從而使精子壽命得到延長(zhǎng)。Gardiner[12]也認(rèn)為體外受精魚(yú)類(lèi)的精子具有三羧酸循環(huán)代謝的能力，可以通過(guò)氧化作用利用細(xì)胞外源性碳水化合物，尤其是葡萄糖、半乳糖和果糖，這三種單糖可以是精子活動(dòng)存活的可選擇和次級(jí)的能源。

保存液不同的稀釋倍數(shù)對(duì)保存效果同樣存在影響。本研究結(jié)果表明，除了保存液D的4倍稀釋效果略?xún)?yōu)于8倍稀釋外，其他保存液8倍稀釋均較4倍稀釋效果好，這與丁淑荃等[4]在實(shí)驗(yàn)中獲得的黃顙魚(yú)保存液以5～7倍的稀釋比例較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2保存精液對(duì)受精率的影響

對(duì)照組的受精率始終保持在90%左右的高受精率水平，且不同時(shí)間點(diǎn)的差異極小，表明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇的雌魚(yú)和雄魚(yú)發(fā)育情況良好，精卵質(zhì)量?jī)?yōu)良。精子保存過(guò)程中運(yùn)動(dòng)受到一定的抑制作用，精子的運(yùn)動(dòng)和滲透壓的維持是一個(gè)耗能的過(guò)程，保存液中精子活力隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)不同程度的下降，推測(cè)跟精子的能量消耗有關(guān)。低溫條件下，保存液B8倍稀釋保存的精子在48h內(nèi)的受精率（84.5%～94.6%）與鮮精（85.3%～94.3%）相比差異極小，受精效果均較好。在48～96h與鮮精相比受精率略微下降，120h后則急劇下降，144h受精率下降至60%左右。該保存液保存的精子在72～96h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)，由此可推測(cè)全雄黃顙魚(yú)人工授精要達(dá)到滿(mǎn)意的受精效果，使用的精液應(yīng)滿(mǎn)足激活后80%以上的精子可以快速運(yùn)動(dòng)，另外保存的精液最好在2～3d內(nèi)使用，保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，受精效果存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)使用前要求鏡檢精子的活力情況。魯大椿等[13-15]的研究結(jié)果表明家魚(yú)人工授精時(shí)，精卵的量比以30萬(wàn)～40萬(wàn)時(shí)受精率最高。大部分的鯉科魚(yú)類(lèi)的精子濃度在60%～70%，密度大都在200億～400億/mL之間，即每毫升原精可以使50萬(wàn)～100萬(wàn)粒魚(yú)卵受精。超雄黃顙魚(yú)的精液量相對(duì)家魚(yú)少得多，精液不能擠出，人工繁殖過(guò)程中合適倍數(shù)的稀釋精液將大大提高生產(chǎn)的效率，減少精液的浪費(fèi)。

3.3超雄黃顙魚(yú)精子在不同濃度NaCl溶液中活力

由于精巢中具有諸多抑制精子活動(dòng)的因素，精子的運(yùn)動(dòng)被抑制[5]，魚(yú)類(lèi)的精子在精巢中是不運(yùn)動(dòng)的，但具有很強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)潛能[16]。當(dāng)精子排出體外，在適當(dāng)?shù)臈l件下精子便開(kāi)始運(yùn)動(dòng)，這一過(guò)程稱(chēng)之為激活[17]。滲透壓是調(diào)節(jié)魚(yú)類(lèi)精子活力的主要因子，魚(yú)類(lèi)精子激活比例隨外界溶液滲透壓的變化而變化，在一定范圍內(nèi)淡水魚(yú)精子激活比例隨外界溶液滲透壓的降低而上升[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度NaCl溶液對(duì)精子的活力與壽命有非常顯著的影響。在0.1%～0.5%的NaCl溶液中，精子壽命均高于直接用水激活。從精子被激活強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間來(lái)看，在0.3% NaCl溶液中精子強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)為38.7s，在0.5%溶液中精子強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間最短為26.0s。從精子數(shù)量來(lái)看，在0.0%～0.3%NaCl溶液中被激活的精子在93%以上，在0.4%～0.5%NaCl溶液中被激活的精子占50%～60%。由此得出0.3%NaCl溶液是超雄黃顙魚(yú)精子的最佳激活液，可提高人工繁殖效率，在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用。

本研究中超雄黃顙魚(yú)精子在濃度為0.0%～0.5%的低滲溶液中，被激活后保持活力的時(shí)間和精子激活率的結(jié)果與黃顙魚(yú)基本一致，最適鹽度范圍為0.2%～0.3%[8]，但與瓦氏黃顙魚(yú)精子激活的最適鹽度范圍為0.45%～0.55%不同[19]，這與魚(yú)類(lèi)不同的生態(tài)習(xí)性存在一定關(guān)系，一般認(rèn)為魚(yú)類(lèi)精子激活最適的條件與其繁殖的環(huán)境相一致。

3.4結(jié)論

魚(yú)類(lèi)精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列階段成為精子。染色體為XY♂的黃顙魚(yú)，產(chǎn)生X、Y兩種精子，而YY♂超雄魚(yú)僅產(chǎn)生Y精子。大量研究表明，X、Y精子存在多方面的差異，如精子膜表面電荷、精子核和頭部的形態(tài)學(xué)差異、對(duì)pH值的敏感性、Y精子中獨(dú)特的乳酸脫氫酶和H-Y抗原、精子密度、泳動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)特性、DNA含量等[20-21]。兩種不同雄魚(yú)的精子組成所適應(yīng)的保存條件要求是否一致，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。研究結(jié)果表明，黃顙魚(yú)精液保存效果良好的保存液對(duì)于超雄黃顙魚(yú)的精子保存同樣具有較好的效果，其中以保存液B的8倍稀釋?zhuān)?.3%NaCl激活液，可以提高繁殖生產(chǎn)的效率，適合在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。但兩者的保存液要求是否完全一致及是否有更加良好的超雄黃顙魚(yú)的精子保存液配方，還需進(jìn)一步深入研究。

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2015-06-08

高雄性率黃顙魚(yú)的雜交育種及規(guī)模化人工繁育技術(shù)推廣，清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013C007）古勇明，男，1960年生，中級(jí)工程師。