李躍輝，王銀，袁清照，張水寒

(湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006)

·中藥工業(yè)·

Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選暈癱通腦片提取工藝△

李躍輝，王銀，袁清照，張水寒*

(湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006)

目的：優(yōu)選暈癱通腦片的提取工藝。方法：以葛根素提取量和浸膏得率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken效應(yīng)面法考察浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果：優(yōu)選得到暈癱通腦片的最佳提取工藝為加水8.6倍量，浸泡63.8 min后提取128.4 min，提取兩次。結(jié)論：通過Box-Behnken效應(yīng)面法及總評(píng)“歸一值”(OD)為評(píng)價(jià)系統(tǒng)優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、簡便易行、預(yù)測性好，可為暈癱通腦片的工藝研究提供參考。

暈癱通腦片；Box-Behnken效應(yīng)面法；總評(píng)“歸一值”；葛根素；浸膏得率

暈癱通腦片是由三七、丹參、葛根、天麻、地龍等7味中藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有活血化瘀，疏通腦脈，平肝熄風(fēng)的功能。臨床用于瘀阻腦絡(luò)兼肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)證，癥見偏癱、麻木、頭暈、頭痛、舌質(zhì)紫暗、脈細(xì)弦、腦動(dòng)脈硬化、中風(fēng)先兆、腦缺血、腦血栓等。原方以湯劑入藥，存在服用量大、易霉變、攜帶儲(chǔ)存不便等缺點(diǎn)[1]，現(xiàn)擬將三七、丹參、全蝎超微粉碎成細(xì)粉，與葛根等余下4味藥的水提干膏粉混合后制成片劑。本課題采用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)暈癱通腦片的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，以期達(dá)到最優(yōu)化，并為探討該法應(yīng)用于優(yōu)化中藥水提取工藝的可行性提供參考。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀(SPD-20A檢測器、LC-20A泵、LC-20B泵)；依利特色譜柱(Hypersil BPS C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；T-214電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

葛根、天麻等4味藥材均購于湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所鑒定室鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》2010版一部各藥材項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定；甲醇(一級(jí)色譜純，Honeywell Burdick & Jackson)；水為重蒸餾水；葛根素對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110752-201313)；其他試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 浸膏得率的測定

按處方比例稱取葛根、天麻等4味藥材共45 g，按表1方法分別操作，濾過，合并濾液，減壓濃縮至一定體積。精密量取濃縮液適量，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱重，計(jì)算浸膏得率[2]。

2.2 葛根素的含量測定

2.2.1 色譜條件 填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相為甲醇-水(25∶75)；進(jìn)樣量為10 μL；流速為1 mL·min-1；檢測波長為250 nm。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于4000[3-4]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 取葛根素對(duì)照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成濃度為 80 μg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取2.1項(xiàng)下的濃縮液適量，蒸干，精密加入30%乙醇50 mL，稱定重量。加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按處方比例稱取除葛根以外的其余各3味藥材適量，加一定量水煎煮一定時(shí)間，濾過，合并濾液，減壓濃縮至一定體積，按2.2.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.5 測定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果陰性樣品無干擾。見圖1。

注：A.葛根素對(duì)照品；B.暈癱通腦片樣品；C.陰性樣品。圖1 暈癱通腦片提取液HPLC圖

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=3 203 659.413 1X-4 189.725 6(r=0.999 9)，線性范圍為0.16～1.28 μg。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果葛根素峰面積的RSD為0.41%，表明儀器精密度良好。

2.3 單因素試驗(yàn)考察

以葛根素提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按以下各項(xiàng)方法提取得濃縮液，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定。

2.3.1 提取時(shí)間 固定加水量為8倍，提取1次，結(jié)果提取時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)，葛根素提取量分別為98.68、136.56、158.24、155.71、154.68 mg，表明在1～2 h內(nèi)隨提取時(shí)間的增加，葛根素的提取量增加，說明葛根素需要一定時(shí)間才能提取完全；2 h后隨提取時(shí)間的增加，葛根素含量開始減少，可能是葛根素的化學(xué)不穩(wěn)定性所致。

2.3.2 加水量 固定提取1次，提取時(shí)間為2 h，結(jié)果加水量分別為6、7、8、9、10倍時(shí)，葛根素提取量分別為118.62、135.61、158.94、160.10、159.89 mg。表明當(dāng)加水量為6～8倍時(shí)，葛根素含量不斷增加，之后增加加水量葛根素含量增加不明顯。

2.3.3 浸泡時(shí)間 固定加水量為8倍，提取1次，提取時(shí)間為2 h，結(jié)果浸泡時(shí)間分別為30、60、90、120 min時(shí)，葛根素提取量分別為126.83、157.89、158.95、158.99 mg。表明浸泡30～60 min時(shí)，葛根素提取量不斷增加；浸泡90～120 min，葛根素提取量增加不明顯。

2.3.4 提取次數(shù) 固定加水量為8倍，提取時(shí)間2 h，結(jié)果提取數(shù)為1、2、3次時(shí)，葛根素提取量分別為157.94、228.56、242.66 mg，說明提取2次已基本提取完全。

2.4 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選

2.4.1 設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果 由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，故采用軟件Design-Expert 8.0.5中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[5-6]，結(jié)合單因素考察試驗(yàn)結(jié)果，固定提取次數(shù)為2次，選取提取時(shí)間、加水量和浸泡時(shí)間3個(gè)因素為考察因素，分別以X1、X2、X3表示，每個(gè)自變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，以葛根素提取量和干膏率的總評(píng)“歸一值”(overall desirability，OD)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)Hassan法對(duì)各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行均一化處理[7]。計(jì)算公式為di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)，式中Yi為實(shí)測值，Ymin和Ymax是指每一指標(biāo)在不同次試驗(yàn)中測得的最小值和最大值，OD=(d1×d2…×dk)1/k，k為指標(biāo)數(shù)。方案及試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.4.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn) 用ANOVA分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)，見表2。由表2可知，提取時(shí)間一次項(xiàng)、提取時(shí)間二次項(xiàng)、加水量一次項(xiàng)、加水量二次項(xiàng)、浸泡時(shí)間一次項(xiàng)、浸泡時(shí)間二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。利用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到OD值對(duì)提取時(shí)間(A)、加水量(B)和浸泡時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸模型：OD=0.93+0.27A+0.056B+0.049C-0.033AB-0.024AC-0.006 35BC-0.45A2-0.082B2-0.16C2，相關(guān)系數(shù)r=0.986 5。整體模型達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，表明該二次方程模型比較顯著。該方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，可以對(duì)不同條件下的OD值進(jìn)行預(yù)測。

表2 回歸方程方差分析

2.4.3 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 采用Design-Expert 8.0.5軟件，根據(jù)回歸方程分析結(jié)果作出相應(yīng)的等高線圖和曲面圖，見圖2～4。圖2顯示在加水量為8倍的條件下，浸泡時(shí)間與提取時(shí)間對(duì)OD值的影響，OD值隨著提取時(shí)間和浸泡時(shí)間的增加均呈二次關(guān)系。當(dāng)提取時(shí)間在120 min左右、浸泡時(shí)間在60 min左右時(shí)，OD值達(dá)到最大值；圖3顯示在浸泡時(shí)間為60 min的條件下，提取時(shí)間與加水量對(duì)OD值的影響，OD值隨著提取時(shí)間和加水量的增加均呈二次關(guān)系。當(dāng)提取時(shí)間在120 min左右、加水量在8倍左右時(shí)，OD值達(dá)到最大值；圖4顯示在提取時(shí)間為120 min的條件下，加水量和浸泡時(shí)間對(duì)OD值的影響，OD值隨著加水量和浸泡時(shí)間的增加均呈二次關(guān)系，當(dāng)浸泡時(shí)間在60 min左右、加水量在8倍左右時(shí)，OD值達(dá)到最大值。

2.4.4 暈癱通腦片水提工藝參數(shù) 結(jié)合二次回歸模型及響應(yīng)面法的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，確定暈癱通腦片的最佳水提工藝參數(shù)：提取時(shí)間為128.4 min，加水量為8.6倍，浸泡時(shí)間為63.8 min，在此條件下理論OD值為0.975 7。

圖2 提取時(shí)間和浸泡時(shí)間對(duì)OD值影響的等高線和響應(yīng)面圖(左等高線，右響應(yīng)面)

圖3 提取時(shí)間和加水量對(duì)OD值影響的等高線和響應(yīng)面圖(左等高線，右響應(yīng)面)

圖4 加水量和浸泡時(shí)間對(duì)OD值影響的等高線和響應(yīng)面圖(左等高線，右響應(yīng)面)

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

取處方量藥材，平行3份，按確定的最佳水提工藝進(jìn)行提取，并進(jìn)行浸膏得率和葛根素提取量的測定，結(jié)果見表3。測定的OD值與理論OD值相近，RSD為0.37%，表明該水提工藝穩(wěn)定可行，且重現(xiàn)良好。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 試驗(yàn)考察指標(biāo)的選擇

葛根素是從葛根中提取得到的一種異黃酮類化合物，能擴(kuò)張腦血管，有效改善微循環(huán)，清除自由基，具有輕度降壓作用[8]。亦有研究表明，葛根素具有保護(hù)和改善高血壓、冠心病等患者的腦血管張力及彈性等方面的作用，具體表現(xiàn)為局部微血管血流及運(yùn)動(dòng)的幅度有增加趨勢[9]，故可將葛根素作為本復(fù)方的指標(biāo)參數(shù)之一。

3.2 優(yōu)選工藝方法的選擇

Box-Behnken設(shè)計(jì)是一種可以評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，與中心復(fù)合設(shè)計(jì)相比，其可不必連續(xù)進(jìn)行多次試驗(yàn)，且在因素?cái)?shù)相同的情況下，試驗(yàn)組合數(shù)少，因而更經(jīng)濟(jì)[10]。本文采用3因素5水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)表安排暈癱通腦片提取工藝試驗(yàn)，以葛根素提取量和干膏率的總評(píng)“歸一值”為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用效應(yīng)面法進(jìn)行最佳提取工藝條件的篩選，優(yōu)選出的最佳提取工藝：提取時(shí)間為128.4 min，加水量為8.6倍，浸泡時(shí)間為63.8 min。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，所建立的模型具有很好的預(yù)測性，所選的工藝條件穩(wěn)定且重現(xiàn)性良好。

[1] 李躍輝，凌艷君，朱沛，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選鼻敏寧顆粒提取工藝[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11(2)：114-116.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[3] 羅唬捷，雷曉林，陳祥吉.葛根口服液的工藝研究及葛根素的測定[J].安徽醫(yī)藥，2008，12 (10)：902-904.

[4] 裴明日，王苗苗，姜麗.高效液相色譜法測定紅寶散中葛根素含量[J].中國藥業(yè)，2014，23(10)：41-42.

[5] 曾銳，任桂友，王爽，等.Box-Behnken設(shè)計(jì)及正交設(shè)計(jì)優(yōu)選復(fù)方龍砂顆粒提取土藝[J].中成藥，2014，36(5)：1091.

[6] 葉陳麗，賀帥，康迎波，等.Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化金翹熱毒清復(fù)方中綠原酸和連翹酯苷A的提取工藝[J].中國藥學(xué)雜志，2014，49(7)：543.

[7] 劉懷偉，鄒俊波，張廷模，等.Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化石解清咽含片提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(21)：14-17.

[8] 鄒清波.葛根素對(duì)心血管系統(tǒng)的藥用價(jià)值[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4(12)：124-125.

[9] 戴琳，余興華.葛根素的藥理作用及臨床應(yīng)用新進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2006，16 (6)：8.

[10] 胡道德，顧磊，姚慧娟，等.中藥提取及優(yōu)化的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(1)：80-83.

Optimization of Extraction Technology of Yuntan Tongnao Tablets by Box-Behnken Design-response Surface Methodology

LI Yuehui，WANG Yin，YUAN Qingzhao，ZHANG Shuihan*

(HunanTCMAcademy，Changsha，Hunan410006，China)

Objective：To optimize extraction process of Yuntan Tongnao tablets by Box-Behnken design-response surface methodology.Methods：On the basis of single factor tests，Box-Behnken experimental design was employed to investigate effects of the extraction time，water amount and the soaking time on puerarin and yield of the extract.Results：The optimized processing parameters were as follows：soaking time 63.8 minutes，8.6 times volume of water，extract time 128.4minutes，twice extraction.Conclusion：The optimized extraction process is proved to be stable，simple，good predictability by Box-Behnken design-response surface methodology and overall desirability，it provides a basis for technology research of Yuntan Tongnao tablets.

Yuntan Tongnao slices；Box-Behnken design-response surface methodology；overall desirability；puerarin；yield of extract

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.017

2015-01-04)

湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2010053)

*

張水寒，研究員，研究方向：中藥制劑；Tel：(0731)88881651，E-mail：zhangshuihan0220@126.com