于曉明，楊傳華，陸峰

(1.江西中醫(yī)藥大學 附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000；2.山東中醫(yī)藥大學 附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011)

·基礎研究·

快律寧膠囊對外源性自由基所致心律失常的影響△

于曉明1*，楊傳華2，陸峰2

(1.江西中醫(yī)藥大學 附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000；2.山東中醫(yī)藥大學 附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011)

目的：研究快律寧膠囊(KLN)對外源性自由基所致心律失常的影響，對比研究KLN與維拉帕米對其的保護作用。方法：將SPF級SD大鼠分為對照組，維拉帕米組和KLN膠囊高、中、低劑量組，采用Langendoff灌流裝置對大鼠離體心臟灌注硫酸亞鐵/抗壞血酸的方法，復制外源性自由基所致大鼠心律失常模型，對比研究KLN膠囊與維拉帕米對其的保護作用。結果：與對照組相比，KLN膠囊可以劑量依賴地減少對外源性自由基所誘發(fā)室性早搏(VEB)、室速(VT)的發(fā)生次數(shù)(P<0.01)；KLN膠囊3個劑量組及維拉帕米組均未出現(xiàn)室顫(VF)，而對照組則誘發(fā)出VF，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組相比，KLN膠囊高劑量組心律失常的出現(xiàn)時間較晚(P<0.05)，而KLN膠囊中低劑量組、維拉帕米組心律失常的出現(xiàn)也有推遲的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組相比，KLN膠囊3個劑量組的心率明顯減慢，而且呈劑量相關性；與對照組性比，KLN膠囊高、中劑量組的心律失常評分明顯降低(P<0.05)，而KLN膠囊低劑量組和維拉帕米組則與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論：KLN膠囊對外源性自由基誘發(fā)的心律失?？赡芫哂蓄A防和治療作用，可以明顯減慢心率，并可能對惡性心律失常(VT、VF)的發(fā)生具有一定的預防作用，其療效優(yōu)于維拉帕米。

快律寧；心律失常；外源性自由基；離體藥效學

心血管疾病是一類威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率和死亡率在各類疾病中占首位。而心律失常發(fā)生率在心血管疾病中排在首位，故心律失常的治療就顯得尤為重要。目前臨床上所用的大多數(shù)抗心律失常藥物在治療心律失常的同時又具有致心律失常作用，或者可引起其他心血管疾病，這使該類藥物的應用受到限制。因此開發(fā)研究新的抗心律失常藥具有一定的臨床意義。心律失常屬于中醫(yī)“心悸”的范疇，心陰虛火旺是快速型心律失常的重要病機之一，快律寧(以下簡稱為KLN)膠囊是在中醫(yī)經(jīng)典理論和治則治法指導下，通過楊傳華教授多年的臨證經(jīng)驗積累，在1994—1999年主持完成山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院立項課題“陰虛火旺型快速型心律失常的臨床證治探討”研究的前提下，逐步形成的山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內制劑。全方由生地、黃連、苦參、當歸、酸棗仁、柏子仁組成，可以“清心火、養(yǎng)心陰、安心神”，適用于心陰虛火旺型的心律失常。本研究是在前期“快律寧”復方有效成分組篩選及安全性評價的基礎上，應用KLN膠囊開展動物實驗模型的離體藥效學研究。采用Langendoff灌流裝置對大鼠離體心臟灌注硫酸亞鐵/抗壞血酸的方法，復制外源性自由基所致大鼠心律失常模型，對比研究KLN膠囊與維拉帕米對其的保護作用。

1 材料

1.1 主要設備和儀器

Langendorff 灌流裝置：自制，蠕動泵，灌流管道系統(tǒng)，恒溫水循環(huán)裝置，超級恒溫浴槽(SC-15寧波新芝生物科技股份有限公司)，水壓測量計，電子天平(AB-17型號，瑞士METT LER TOLEDO，精度為0.000 1 g)、超凈工作臺、防震臺，玻璃毛坯(上海實生細胞生物技術有限公司)；Intel P4，256 MB，40GB計算機。BL-420生物機能實驗系統(tǒng)+通用放大器(成都泰盟科技有限公司)、常規(guī)手術器械、注射器。

1.2 主要試劑及其配制

戊巴比妥鈉(分析純，上?；瘜W試劑采購站分裝廠，批號：96-01-22)：配成3%溶液備用。

肝素鈉(12 500 U/支，天津萬邦生化醫(yī)藥有限公司，批號：1201115-a)：配成1%溶液備用。

鹽酸普羅帕酮注射液(SIGMA公司，批號：110401)：加等容積注射用水稀釋。

Krebs-Henseleit緩沖液(mmol·L-1)：NaCl 118，KCl 4.7，MgS04·7H20 1.2，KH2P041.2，NaHC0325.0，CaCl22.5，Glucose 11.0，pH 7.4，滲透壓300 mOsm·L-1)。

KLN膠囊(江蘇江陰藥業(yè)有限公司，0.48 g/粒，批號：20110920)，以0.9%氯化鈉溶液按設計分別稀釋，調pH至7.40，0.45 μm微孔濾膜過濾，分裝備用。

鹽酸維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號：4E12002)：2 mL∶5 mg。

1.3 動物選擇

健康成年SD大鼠(北京維通利華公司，SPF級)30只，雌雄各半，體重240～270 g，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(京)2007·004。

2 方法

2.1 分組方法

按性別和體重，采用隨機數(shù)字表法等分為5組(n=6)：對照組、KLN膠囊高劑量組、KLN膠囊中劑量組、KLN膠囊低劑量組、維拉帕米組。

2.2 Langendoff心臟灌流

用2%戊巴比妥鈉0.2 mL·(100 g)-1和1%肝素鈉0.5 mL·(100 g)-1同時對大鼠腹腔注射。動物麻醉后，取仰臥位固定，開胸，在距主動脈起始部3～4 mm處取下心臟，迅速放入預冷0 ℃灌流液中停跳，沖洗心腔和血管內的殘留血液后，將心臟迅速移置到Langendoff灌流裝置進行非循環(huán)不作功灌流，灌流壓0.82 kPa。灌流液為Krebs-Henseleit緩沖液。灌流前以95%O2+5%CO2混合氣平衡15 min，灌流中持續(xù)通氣。在整個灌流過程中，用SC-15型超級恒溫水浴器使灌流液保持在37 ℃，pH 7.4，冠脈壓力用恒流泵控制在9.8 kPa(100 cmH2O)，灌流過程中，鉑金電極的兩極分別置于心臟表面的左上及右下角，記錄II導聯(lián)心電圖。

2.3 分組灌流給藥

對照組：離體心臟預灌15 min后，灌流液中加入硫酸亞鐵(0.25 mmol·L-1)/抗壞血酸(1.0 mmol·L-1)持續(xù)灌注30 min，觀察心電圖變化。KLN膠囊的高、中、低劑量組：灌流液中分別加入藥物3、1、0.3 g·L-1，預灌15 min后，灌流液中加入硫酸亞鐵(0.25 mmol·L-1)/抗壞血酸(1.0 mmol·L-1)持續(xù)灌注30 min，觀察心電圖變化。維拉帕米組：灌流液中以1 mg·L-1濃度加入維拉帕米預灌15 min后，灌流液中加入硫酸亞鐵(0.25 mmol·L-1)/抗壞血酸(1.0 mmol·L-1)持續(xù)灌注30 min，觀察心電圖變化。

2.4 實驗觀察指標

室性早搏(VEB)：指偶發(fā)提前發(fā)生的室性QRS波，包括二聯(lián)律；室速(VT)是連續(xù)4個(或)以上的VEB；室顫(VF)波幅紊亂且低于正常的QRS波。

心律失常出現(xiàn)時間(min)：指從灌流液中加入硫酸亞鐵/抗壞血酸開始至出現(xiàn)心律失常的時間。

心率差：指預灌流K-H液后心電圖穩(wěn)定后的平均心率與灌流液中加入硫酸亞鐵/抗壞血酸30 min后的平均心率的差。

心律失常評分法：采用Lambeth會議標準[1]，采用Curtis-Walker法結合Mest法，在每段觀察時間內取其最嚴重的1種心律失常相對應的分數(shù)作為其心律失常評分。評分標準如下：0分，無心律失常；1分，房性心律失常，偶發(fā)室性早搏(指1 min內發(fā)生3次以下的室性早搏)；2分，頻發(fā)性室性早搏(指1 min內發(fā)生3次或3次以上的室性早搏)；3分，偶發(fā)性室速(指1 min內發(fā)生3次以下的室速)；4分，頻發(fā)性室速(指1 min內發(fā)生3次或3次以上的室速)或偶發(fā)性室顫(指1 min內發(fā)生3次以下的室顫)；5分，頻發(fā)性室顫(指1 min內發(fā)生3次或3次以上的室顫)或死亡。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 心律失常個數(shù)的比較

由表1可知，灌流液中加入硫酸亞鐵/抗壞血酸后各組大鼠離體心臟均出現(xiàn)不同程度的心律失常，與對照組相比，KLN膠囊高中低劑量組、維拉帕米組VEB、VT的個數(shù)明顯減少(P<0.01)，而且呈劑量相關性，KLN膠囊劑量越高出現(xiàn)VEB、VT的個數(shù)越少。將KLN膠囊高中低3個劑量組與維拉帕米組比較，結果差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。灌流KLN膠囊高中低劑量組、維拉帕米組的大鼠離體心臟均未出現(xiàn)VF，而對照出現(xiàn)VF，但經(jīng)統(tǒng)計發(fā)生個數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。

表1 各組加入硫酸亞鐵/抗壞血酸30 min內出現(xiàn)心律失常個數(shù)的比較 /個

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 心律失常出現(xiàn)時間、心率差及心律失常評分的比較

由表2可知，將KLN膠囊高中低劑量組、維拉帕米組分別與對照組比較，KLN膠囊高劑量組心律失常的出現(xiàn)時間明顯延遲(P<0.05)，KLN膠囊中低劑量組、維拉帕米組的心律失常出現(xiàn)時間也有延后的趨勢，但經(jīng)統(tǒng)計差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 心律失常出現(xiàn)時間、心率差及心律失常評分的比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

實驗發(fā)現(xiàn)，對照組在灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸后，心率差為負值，即出現(xiàn)心率加快，而預灌流KLN膠囊和維拉帕米后再灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸后心率差為正值，即出現(xiàn)心率的減慢，與對照組的心率差值相比差異都具有統(tǒng)計學意義，而且心率差的大小與KLN膠囊劑量呈相關性，KLN膠囊濃度越高則心率減慢越明顯。

預灌流KLN膠囊高、中劑量組后再灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸與對照組相比，心律失常評分明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而預灌流KLN膠囊低劑量組和預灌流維拉帕米組的心律失常評分與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

4 討論

再灌性心律失常的發(fā)生機制，是國內外心血管研究領域中的熱點之一。其發(fā)生機制尚未完全闡明，但其生化基礎多認為與鈣超負荷和氧自由基的大量產(chǎn)生有關。氧自由基參與了缺血時心功能障礙、缺血后心肌“頓挫”和再灌注損傷的病理過程[2-3]。本實驗采用硫酸亞鐵(0.25 mmol·L-1)/抗壞血酸(1.0 mmol·L-1)作為外源性自由基生成系統(tǒng)，成功復制出自由基致心律失常的模型。

本實驗灌流液中加入硫酸亞鐵/抗壞血酸后，各組大鼠離體心臟均出現(xiàn)不同程度的心律失常，與對照組相比，KLN膠囊高、中、低劑量組的VEB、VT個數(shù)明顯減少(P<0.01)，而且呈劑量相關性，KLN膠囊劑量越高出現(xiàn)VEB、VT的個數(shù)越少。灌流KLN膠囊高中低劑量組的大鼠離體心臟均未出現(xiàn)VF，而對照組出現(xiàn)VF，但經(jīng)統(tǒng)計差異無統(tǒng)計學意義。室速、室顫為嚴重的室性心律失常，是心源性猝死的主要原因之一，因此可以推測KLN膠囊對外源性自由基所導致的心律失常，尤其是對惡性心律失常有很好的預防作用，而且劑量越高作用越強。

實驗發(fā)現(xiàn)預灌流KLN膠囊后，與對照組相比，高劑量組心律失常首次出現(xiàn)時間明顯延遲，中、低劑量組心律失常首次出現(xiàn)時間有延遲的趨勢，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。預灌流KLN膠囊高、中劑量組后再灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸與對照組相比，心律失常評分明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而預灌流KLN膠囊低劑量組的心律失常評分則與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。因此證明KLN膠囊可以劑量依賴性地保護心臟、預防或延遲心律失常的發(fā)生。

對照組在灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸后，出現(xiàn)心率明顯加快，用藥前后心率差為負值，而預灌流KLN膠囊后再灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸后出現(xiàn)心率明顯減慢，用藥前后心率差為正值，與對照組的心率差值相比差異都具有統(tǒng)計學意義，而且心率差的大小與KLN膠囊劑量呈相關性，KLN膠囊濃度越高則心率減慢越明顯。因此證明KLN膠囊可以劑量依賴性地降低心率。

維拉帕米為選擇性阻滯心肌細胞膜慢鈣通道，抑制Ca2+內流，主要影響竇房結、房室結等慢反應細胞?？梢砸种?相緩慢去極化，使自律性降低，心率減慢；降低房室結0相去極化速度和幅度，使房室傳導速度減慢；使ERP延長，有利于消除折返。維拉帕米對室上性和房室結折返引起的心律失常效果好，陣發(fā)性室上性心動過速的急性發(fā)作已成為首選。本實驗證實預灌流維拉帕米組與對照組相比心率明顯減慢(P<0.05)，灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸后出現(xiàn)VEB、VT、VF的個數(shù)明顯減少(P<0.01)，心律失常首次出現(xiàn)時間明顯延遲，由此可證明其有效性。而將KLN膠囊高、中、低3個劑量組的心律失常個數(shù)分別與維拉帕米組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而且統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)KLN膠囊高、中劑量組的心律失常評分要低于維拉帕米組，因此可以推測KLN膠囊對外源性自由基所導致的心律失常的預防作用要優(yōu)于維拉帕米。

現(xiàn)代研究表明，KLN膠囊組方中很多中藥具有清除自由基的作用。當歸中的有效成分阿魏酸可直接消除自由基、抑制超氧自由基引起的膜脂質過氧化反應以及與生物膜磷脂結合保護膜脂質等多種機理拮抗自由基對組織的損害[5]。黃連所含的小蘗堿具有清除自由基的作用[4]。酸棗仁中所含的脂肪油、酸棗仁皂苷、黃酮類化合物、阿魏酸等具有清除自由基和抗氧化的作用[6]。

鈣超負荷是自由基致心律失常的另一重要機制，KLN膠囊組方藥物中的黃連、苦參、生地、當歸、酸棗仁均對鈣通道有阻滯作用，因此推測KLN膠囊可能具有阻滯鈣通道、抑制鈣超負荷的作用，從而預防心律失常的發(fā)生，具有類似IV類抗心律失常藥的特點。

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EffectofFastLawCapsuleonArrhythmiasInducedbyExogenousFreeRadical

YUXiaoming1*，YANGChuanhua2，LUFeng2

(1.AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330000，China；2.AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250011，China)

Objective：To study the effect of the Fast-law Capsules(KLN) on arrhythmias induced by exogenous free radical，and compare the protective effect，between KLN and verapamil.Methods：SPF SD rats were divided into control group，verapamil group and KLN capsules high，medium and low-dose groups，the method of ferrous sulfate/ascorbic acid Langendoff perfusion of isolated rat heart was applied，exogenous free radicals induced arrhythmias in rats was copied.Results：Compared with the control group，KLN capsule showed a dose-dependent reduction in the number of occurrences of exogenous free radicals induced VEB and VT(P<0.01).VF did not occured in KLN capsule three dose groups and verapamil group，while the control group induced VF，but there was no significant difference(P>0.05) by the statistics.Compared with the control group，the emergence of high-dose group time capsule KLN late arrhythmia(P<0.05)，while the KLN capsule low dose group，verapamil group also has delayed the emergence of arrhythmia trend，but after There was no significant statistical difference(P>0.05).Compared with the control group，pulse rate in KLN capsule three dose groups significantly slowed down，and showed a dose-dependent relationship Compared with the control group，KLN capsule high dose group significantly reduced arrhythmia score(P<0.05)，while the low-dose group and KLN capsule verapamil group were no significant differences( Pand the control group>0.05).Conclusion：KLN capsule has an effect on exogenous free radical-induced arrhythmias，and can slow down pulse rate.Its efficacy is superior to verapamil.

Fast-law capsule；arrhythmia；exogenous free radicals；vitro pharmacodynamics

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.009

2014-11-30)

國家科技重大新藥創(chuàng)制專項課題——抗快速性心律失常中藥候選新藥研究(2009ZX09103-43)

*

于曉明，博士，研究方向：中醫(yī)藥治療心腦系疾?。籈-mail：dryxm@163.com