彭智發(fā)　福建省泉州市洛江區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心　福建泉州　362011

熒光定量PCR法檢測點帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒研究

彭智發(fā)福建省泉州市洛江區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心福建泉州362011

根據(jù)己公布的神經(jīng)壞死病毒全基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件依據(jù)GeneBank所收錄的各種石斑魚神經(jīng)壞死病毒RNA2基因組全序列選擇保守區(qū)域，根據(jù)Taqman探針引物設(shè)計原則，設(shè)計TaqMan探針及其引物。采用TaqMan探針技術(shù)，并且將假病毒技術(shù)構(gòu)建的含有神經(jīng)壞死病毒RNA2基因組的MS2噬菌體假病毒作為陽性質(zhì)控品，建立TaqMan探針檢測點帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒的熒光定量PCR方法，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠在病毒檢測中進行絕對定量，能檢測到10個病毒拷貝模板數(shù)，在臨床檢測中得到很好運用。本研究建立實時熒光定量RT-PCR，有助于日常檢驗工作，為魚類神經(jīng)壞死病毒的篩選和監(jiān)測提供基礎(chǔ)，有助于控制神經(jīng)壞死病的疫情傳播。

熒光定量PCR點帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒（NNV）

魚類病毒性神經(jīng)壞死?。╲iral nervous necrosis，VNN）又稱病毒性腦病和視網(wǎng)膜?。╲iral encephalopathy and retinopathy，VER），其致病原為神經(jīng)壞死病毒（Nervous Necrosis Virus），是世界范圍的一種魚類流行性傳染病，對仔魚和幼魚危害很大，嚴(yán)重者在一周內(nèi)死亡率可達100%，對成魚也有很高的致死率。由于其極高的傳染性和危害性，被國際獸疫組織（OIE）列為重要的魚類病害［1］。該病毒為兩條單股RNA，分別為RNA1和RNA2，其中RNA1的功能為 RNA-dependent RNA polymerase（RdRp），RNA2則可以轉(zhuǎn)錄翻譯出病毒的外殼蛋白［2-4］。近幾年在我國南方各省養(yǎng)殖的各種石斑魚常常暴發(fā)流行VNN，給石斑魚養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失［5-7］，建立一種快速、安全的檢測方法已經(jīng)迫在眉睫。Taq-Man熒光探針定量PCR技術(shù)己廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物的診斷領(lǐng)域，不但提高了PCR的檢測靈敏度，還能對模板進行準(zhǔn)確定量檢測，特別適用于動物傳染病的診斷和檢測。本研究的目的是建立實時熒光定量RT-PCR技術(shù)，用于臨床NNV快速診斷。

1　材　料

1.1病料疑似患病點帶石斑魚魚苗來自福建省漳州市某石斑魚育苗場，經(jīng)RT-PCR方法檢測證明是NNV陽性?；铙w采集患病魚苗，整魚凍存于-80℃冰箱備用。

1.2引物和探針應(yīng)用引物設(shè)計軟件依據(jù)GeneBank所收錄的各種石斑魚神經(jīng)壞死病毒RNA2基因組全序列選擇保守區(qū)域同時設(shè)計Taq-Man探針及其引物。探針和引物由上海生物工程有限公司合成。正向引物：GGACCTCGTCGGGAAAGGAG，反向引物：GACACAGCACTGACACGTTGA，探針：CGTCACCTGGTCGGCTGATACTCCTGT。探針的熒光標(biāo)記選擇FAM作為報告基團，TAMRA為淬滅基團。

1.3陽性質(zhì)控品本實驗室保存的采用假病毒技術(shù)克隆的含石斑魚NNV編碼主衣殼蛋白的RNA2基因片段的MS2噬菌體。病毒RNA基因組取自點帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒編碼MCP的RNA2，擴增片段長為 635 bp，用于擴增的正向引物為：5'-ACAACGATCACACCTTCGACG-3'，反向引物為：5'-AACCGGATGACCCGGTTAGTT-3'。

1.4儀器和試劑PE7300熒光定量PCR儀、PE9700PCR儀購自PE公司；Hotstart-Taq酶購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司；RNA抽提試劑盒以及RT-PCR試劑購自Promega公司。

2　方　法

2.1標(biāo)準(zhǔn)品制備MS2噬菌體陽性質(zhì)控品，用紫外分光光度計測重組MS2噬菌體質(zhì)控品濃度，然后按以下公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度×阿氏常數(shù)k（一個堿基對的平均分子量×質(zhì)粒的總長度）。其中，阿氏常數(shù)為6.02×1023，一個堿基對的平均分子量為648，重組質(zhì)粒的總長度為3 659 bp。MS2噬菌體陽性質(zhì)控品作10倍梯度稀釋。用紫外分光光度計測定MS2噬菌體陽性質(zhì)控品的OD值，計算其濃度，并依次稀釋成含質(zhì)粒數(shù)量分別為1010、109、108……101、100個拷貝，共10個樣品梯度作為標(biāo)準(zhǔn)品，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)采用一步法在定量熒光PCR儀上完成cDNA和RT-PCR過程。反應(yīng)體系為25μL，其中含核酸模板5μL，M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶（20 U/μL）0.15μL，RNA酶抑制劑（20 U/ μL）0.2μL，Taq酶（5 U/μL）0.2μL，正、反向引物各0.2μL（40μmol），TaqMan探針0.2μL（40μmol），dNTP 0.2μL，10×Taq酶緩沖液 2.5μL，MgCl2（25mmol）2.5μL，加滅菌雙蒸水至25μL。PCR程序設(shè)定為：42℃ 30 min、95℃ 5 min，然后95℃20 s、58℃40 s循環(huán)40次。陰性控制用DEPC處理的雙蒸水作模板。

2.3實時熒光定量RT-PCR的特異性用建立的RRT-PCR同時檢測神經(jīng)壞死病毒（NNV）、真鯛虹彩病毒 （RSIV）、蝦白斑病毒 （WSSV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬藍耳病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、沙門氏菌（Salm），并設(shè)立陽性和陰性對照。觀察實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)的特異性。

2.4MS2噬菌體陽性質(zhì)控品的重復(fù)性與穩(wěn)定性測試對MS2噬菌體陽性質(zhì)控品在同樣條件下以4個不同濃度梯度，同時進行4次重復(fù)檢測，測定組間變異系數(shù)，并判斷MS2噬菌體陽性質(zhì)控品的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表1　MS2噬菌體陽性質(zhì)控品重復(fù)檢測曲線Ct值

2.5MS2噬菌體陽性質(zhì)控品線性范圍的確定通過MS2噬菌體陽性質(zhì)控品的梯度依次進行10倍稀釋，同時取5～8個梯度同時進行RRT-PCR，觀察熒光擴增曲線圖和Ct值，以確定MS2噬菌體陽性質(zhì)控品良好擴增的線性范圍。

2.6MS2噬菌體陽性質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立通過已確立能夠進行良好擴增的MS2噬菌體陽性質(zhì)控品的稀釋梯度范圍，擬合曲線生成一條線性方程（y=kx+b），為絕對定量做好鋪墊。

2.7臨床病料的實時熒光定量RT-PCR檢測以建立的實時熒光定量RT-PCR方法臨床檢測疑似含有神經(jīng)壞死病毒的魚苗肝臟及腦組織樣品。

3　結(jié)　果

3.1實時熒光定量RT-PCR的特異性測試用建立的RRT-PCR同時檢測神經(jīng)壞死病毒 （NNV）、真鯛虹彩病毒（RSIV）、蝦白斑病毒（WSSV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬藍耳病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、沙門氏菌（Salm），并設(shè)立陽性和陰性對照。結(jié)果表明，只有神經(jīng)壞死病毒呈陽性，其他結(jié)果均為陰性。

3.2RRT-PCR與常規(guī)RT-PCR敏感度的比較用本試驗建立的快速檢測NNV的常規(guī)RT-PCR方法檢測陽性質(zhì)控品的5個稀釋度，檢測結(jié)果能達到100 pg級核酸含量。本試驗所建立的RRT-PCR則最少可以檢測到10拷貝量的病毒量，比RT-PCR方法至少敏感10倍。

3.3MS2噬菌體陽性質(zhì)控品的重復(fù)性與穩(wěn)定性測試對陽性質(zhì)控品MS2噬菌體在103～107copies/μL 的5個稀釋度進行4次重復(fù)檢測，每個濃度的Ct值見表1，擴增圖見圖1，統(tǒng)計學(xué)分析其Ct值變異系數(shù)（CV）分別為0.20%、0.54%、0.22%、0.03%、0.26%，曲線的回歸系數(shù)R2為0.997。

3.4MS2陽性質(zhì)控品線性范圍的確定將陽性質(zhì)控品按109～103copies/μL濃度，按上述體系和反應(yīng)進行擴增，結(jié)果如圖2。篩選出以107-103copies/μl為理想濃度，濃度過高或過低均會對擴增曲線產(chǎn)生影響。本試驗建立的RRT-PCR方法最少可以檢測到10個病毒拷貝數(shù)，在較廣的范圍內(nèi) （103～107copies/μL）Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)值R2=0.997。

3.5MS2噬菌體陽性質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用MS2噬菌體陽性質(zhì)控品進行擴增，擬合出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率為-3.392，截距為7.829，從而可以得出拷貝數(shù)（Copy number）與循環(huán)閾值（Ct）之間的線性關(guān)系曲線表達式：Ct=-3.392lgCopy number+7.829，而待測樣品的Ct值可以從儀器中讀??；把待測樣品的Ct值代入表達式就可以算出其初始拷貝數(shù)。從建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.997，證明試驗誤差較小，該標(biāo)準(zhǔn)樣品作為熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品是合格的（見圖2-圖3）。

圖1　MS2陽性質(zhì)控品在濃度為103～107copies/μL的實時熒光定量擴增曲線圖

圖2　MS2噬菌體陽性質(zhì)控品擴增曲線圖

3.6臨床病料的實時熒光定量RT-PCR檢測用建立的NNV RRT-PCR檢測疑似病毒性神經(jīng)壞死病的點帶石斑魚臨床樣品，并觀察擴增曲線。結(jié)果顯示（見圖4）：陰性對照樣品無Ct值或無擴增曲線，陽性對照107拷貝 （MS2噬菌體陽性質(zhì)控品）Ct值為19.87，符合判定標(biāo)準(zhǔn)，表明陰性對照和陽性對照成立。樣品1～5的Ct值及結(jié)果判斷分別為：20.89（陽性）、22.57（陽性）、24.02（陽性）、27.15（陽性）。

4　討　論

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）問世以來，憑其靈敏性、特異性和快速性廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)等領(lǐng)域。TaqMan-MB熒光探針定量PCR技術(shù)已經(jīng)在臨床病原微生物的診斷領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在動物傳染病方面的診斷，能定量檢測病毒在機體內(nèi)的分布及感染強弱，實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，以特異性強、速度快、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、靈敏度高及全封閉反應(yīng)等優(yōu)點成為分子生物學(xué)領(lǐng)域中的重要工具。本研究的目的是建立實時熒光定量RT-PCR技術(shù)，用于臨床NNV快速診斷，為此，我們根據(jù)GeneBank中登錄的NNV衣殼蛋白的核昔酸序列設(shè)計引物和探針，并優(yōu)化試驗條件和反應(yīng)體系，通過多次對不同樣品的重復(fù)性檢測，結(jié)果顯示具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。其敏感性比RT-PCR敏感10倍，最小可檢出10個病毒拷貝數(shù)。

圖3　濃度為103～107copies/μL的陽性質(zhì)控品的實時熒光定量RT-PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線（注：橫坐標(biāo)為質(zhì)粒的拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為循環(huán)閾值）

圖4　實時熒光定量RT-PCR對臨床樣品檢測曲線圖

構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品和擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線是運用實時熒光定量PCR準(zhǔn)確檢測樣品的前提。本試驗采用基因工程手段構(gòu)建出含有NNV基因片段與包裝蛋白形成的蛋白-RNA復(fù)合體，即假病毒，用于構(gòu)建石斑魚NNV RT-PCR檢測的陽性質(zhì)控品［6］。該陽性對照可以真實體現(xiàn)病毒核酸的提取過程，對病毒的裂解、提取過程進行質(zhì)控，與待檢樣品同時完成RNA提取和RT-PCR檢測過程。陽性質(zhì)控品可用來排除由試劑本身失效、操作異常導(dǎo)致的“假陰性”，是進行PCR檢測必不可少的因素。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)注意以下幾個方面：（1）標(biāo)準(zhǔn)品要精確稀釋。（2）DNA要高度純化。（3）標(biāo)準(zhǔn)品要有強穩(wěn)定性［8］。本試驗選用純化好的MS2噬菌體陽性質(zhì)控品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，且選用了10個稀釋度的樣品進行熒光定量PCR擴增，發(fā)現(xiàn)起始濃度越高，Ct值越小，因此，起始濃度與Ct值之間具有很好的線性關(guān)系，并成功制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以建立的熒光定量PCR方法同時檢測神經(jīng)壞死病毒（NNV）、真鯛虹彩病毒（RSIV）、蝦白斑病毒（WSSV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬藍耳病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、沙門氏菌（Salm），并同時設(shè)立陽性和陰性對照。結(jié)果表明，只有神經(jīng)壞死病毒呈陽性，其他結(jié)果均為陰性。證明本研究建立的檢測方法具有良好的特異性。對MS2噬菌體陽性質(zhì)控品在同樣的條件下，以4個不同濃度梯度同時進行4次重復(fù)檢測，得到較低的組間變異系數(shù)，因而具有較好的穩(wěn)定性。同時在較廣的范圍內(nèi)（103～107copies/μL），Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)之間呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)值R2=0.997。建立的Taqman實時熒光定量PCR方法，為魚類神經(jīng)壞死病毒研究提供了一種新的檢測方法。對魚類神經(jīng)壞死病毒的監(jiān)測是控制并消滅魚類神經(jīng)壞死病毒病的重要前提。

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Research of real-time quantitative RT-PCR detected Epinephelus lanceolatus grouper nervous necrosis virus

Peng Zhifa
（Animal Disease Prevention and Control Center of Luojiang District，Quanzhou，F(xiàn)ujian 362011）

According to the study published by the others nervous necrosis virus gene sequence，application primer design software based on GeneBank contains various grouper nervous necrosis virus RNA genome sequence choose conservative region while TaqMan probe design and primers.TaqMan probe technology，and will leave Construction of the virus containing nerve necrosis virus RNA genome of the virus MS2 bacteriophage as a positive controls，a TaqMan probe brings grouper nervous necrosis virus fluorescence quantitative PCR，and the establishment of a standard curve，which can detect virus testing for absolute quantification，the minimum can detect 10 viruses，In actual use of detection achieved very good results.The establishment of real-time quantitative RT-PCR and contribute to future coastal ports in the day-to-day inspection and fish and nervous necrosis virusmonitoring provided by the foundation，will help to control the nervous necrosis disease spread of the epidemic.

real-time quantitative RT-PCR Epinephelus lanceolatus NNV

A

1003-4331（2015）01-0015-04