葉 鳴 ，王志剛 ，周 鴻 ，牛誠(chéng)誠(chéng) ，陳昶宇 ，劉 瑩

（1.成都市第三人民醫(yī)院-重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院，四川 成都 610010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像研究所，重慶 400010；3.中南大學(xué)湘雅二院超聲科，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

隨著超聲分子顯像技術(shù)的不斷發(fā)展，靶向超聲造影劑的設(shè)計(jì)及制備已成為目前的研究熱點(diǎn)。靶向超聲造影劑可以作為治療藥物或基因的載體，通過(guò)血液循環(huán)特異性地聚集于靶組織，觀察靶組織在分子或細(xì)胞水平的特異性顯像，在腫瘤治療方面顯示出巨大的潛力[1-2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C在誘導(dǎo)腫瘤淋巴管形成和促進(jìn)腫瘤的淋巴結(jié)播散中起到至關(guān)重要的作用。而阻斷VEGF-C/VEGFR-3信號(hào)途徑在臨床抗腫瘤淋巴管新生和腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移方面具有良好應(yīng)用前景[3]。

本研究采用抗VEGFR-3單克隆抗體為配體，制備出靶向載藥脂質(zhì)微泡超聲造影劑，探討其在體外的顯影效果及在人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的體外尋靶能力，為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器

DSPE-PEG（2000）Biotin（Avanti，美國(guó)）；DPPC、DPPE、DPPA （Lipoid， 德國(guó)）； 阿霉素(Adriamycin)（Sigma，美國(guó)）；抗人VEGFR-3單克隆抗體（R&D systems，美國(guó)）；鏈親和素（Sigma，美國(guó)）；N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯 （Biotiny-N-hy-droxy-succinimide，BNHS）HABA/Avidin 試劑（Sigma，美國(guó)）；熒光染料 DiI（Sigma，美國(guó)）；THZ-C 恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；高速冷凍離心機(jī)5804R（德國(guó)Eppendorf公司）；倒置熒光顯微鏡（Olympus CKX41，Japan）。

1.2 生物素化抗體的制備及檢測(cè)

將抗人VEGFR-3單抗透析，加入到微孔濾膜管中，然后再向管中加入一定量的BNHS（1 mg/mL），孵育后離心，再加入PBS，混勻后再次離心，去除外管濾液，加入PBS制成樣品溶液。將PBS加入比色皿中作為空白對(duì)照管，在另一比色皿中加入一定量HABA/Avidin試劑，分別測(cè)定于加入樣品溶液前后其500 nm處的吸光度值A(chǔ)1、A2；在第三個(gè)比色皿中加入一定比例的PBS和樣品溶液，并測(cè)定其在500 nm的吸光度值A(chǔ)3，根據(jù)HABA/Avidin試劑說(shuō)明書中的公式計(jì)算，檢測(cè)抗體的生物素化程度[4]。

1.3 載藥靶向超聲微泡的制備

稱量阿霉素、成膜磷脂材料DSPE-PEG（2000）Biotin、DPPC、DPPE、DPPA， 按照一定比例混合，加入少量熒光染料DiI，溶于一定量1∶1的甲醛和三氯甲烷中，待甲醛和三氯甲烷自然揮發(fā)完全后，加入一定量的甘油和PBS，放入45℃的水域中孵育半小時(shí)，再?zèng)_入氟碳?xì)怏w，經(jīng)50 s振蕩后得到載阿霉素脂質(zhì)超聲微泡。將上述制得的載藥微泡加入過(guò)量的鏈親和素中，低溫振蕩孵育半小時(shí)后，反復(fù)低溫低速離心洗滌；然后加入上述所制備的生物素化抗人VEGFR-3單克隆抗體，再經(jīng)低溫孵育半小時(shí)，反復(fù)低溫低速離心洗滌，便得到靶向VEGFR-3載阿霉素脂質(zhì)微泡超聲造影劑。

1.4 靶向載藥超聲脂質(zhì)微泡的體外顯影實(shí)驗(yàn)

將一系列按倍比稀釋的靶向載藥脂質(zhì)微泡 （微泡平均濃度分別為 3.10×109個(gè)/mL、1.55×109個(gè)/mL、0.75×109個(gè)/mL）置入用凝膠（1%）制成的孔洞模型中，以PBS作為對(duì)照。采用Philips iU22超聲診斷儀，基波成像模式，掃查聲束與孔洞長(zhǎng)軸垂直，應(yīng)用機(jī)械指數(shù)（MI 0.7）的超聲采集各孔中的超聲圖像。

1.5 倒置熒光顯微鏡下觀察靶向載藥脂質(zhì)微泡超聲造影劑對(duì)人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，以1×104/孔的密度接種于置有消毒蓋玻片的6孔板底部。待細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，制備細(xì)胞爬片。預(yù)設(shè)為靶向造影劑實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，各3張。吸干培養(yǎng)液，每組爬片采取不同操作：①靶向造影劑實(shí)驗(yàn)組內(nèi)加入靶向載藥脂質(zhì)微泡超聲造影劑200 μL；②空白對(duì)照組內(nèi)加入非靶向載藥脂質(zhì)微泡超聲造影劑200 μL。于 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1 h。1 h 后，取出爬片，以PBS緩沖液反復(fù)沖洗每張片5次，在光鏡和熒光顯微鏡下觀察結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 抗體生物素化程度

根據(jù)HABA/Avidin試劑說(shuō)明書公式算出，每個(gè)單克隆抗體分子平均可與9個(gè)生物素分子結(jié)合。

2.2 載藥靶向微泡的物理性質(zhì)

光鏡下觀察顯示微泡呈球形，表面光滑，粒徑大小較一致，分散較均勻，平均粒徑為1.66 μm（圖1）。

圖1 靶向載藥微泡粒徑圖。馬爾文激光粒徑儀測(cè)量靶向載藥微泡的平均粒徑為1.66 μm。Figure 1.Size of VEGFR-3-targeted lipid microbubble ultrasound contrast agents containing adriamycin.Itsmean diameter:1.66 μm.

2.3 靶向載藥超聲脂質(zhì)微泡的體外顯影效果

體外顯影結(jié)果顯示，與PBS對(duì)比，靶向載藥脂質(zhì)微泡顯示高回聲，且回聲強(qiáng)度隨微泡濃度減小呈下降趨勢(shì)（圖2）。

2.4 倒置熒光顯微鏡下觀察靶向載藥超聲脂質(zhì)微泡造影劑對(duì)人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的尋靶能力

400倍光鏡下觀察到：①載藥靶向微泡造影劑組，較多量載藥靶向微泡造影劑與人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞緊密結(jié)合，主要分布在細(xì)胞周邊以及細(xì)胞壁游離面上（圖3）。②空白對(duì)照組，在PBS的反復(fù)沖洗下，細(xì)胞周圍觀察不到或僅見少量造影劑黏附。400倍熒光顯微下觀察，在與白光同一視野下：①載藥靶向微泡造影劑實(shí)驗(yàn)組，可見大量靶向造影劑形成圓環(huán)，發(fā)出強(qiáng)烈紅色熒光；②空白對(duì)照組，未見或僅見少量的熒光。

圖2 靶向載藥超聲脂質(zhì)微泡體外顯影。1：PBS（MI=0.7）；2～4：靶向載藥超聲脂質(zhì)微泡濃度分別為：0.75×109個(gè)/mL、1.55×109個(gè)/mL、3.10×109個(gè)/mL（MI=0.7）；5～8：靶向載藥超聲脂質(zhì)微泡濃度為0.75×109個(gè)/mL，MI依次為0.6、0.5、0.4、0.3。 圖3 靶向載藥造影劑實(shí)驗(yàn)組結(jié)合情況圖。光鏡下及熒光鏡下觀察到較多的載藥靶向超聲微泡造影劑與人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞緊密結(jié)合，且主要分布在細(xì)胞周邊以及細(xì)胞壁游離面上。Figure 2. 1:PBS(MI=0.7);2～4:VEGFR-3-targeted lipid microbubble ultrasound contrast agents concentration:0.75×109/mL,1.55×109/mL,3.10×109/mL(MI=0.7);5～8:its concentration:0.75×109/mL,their MI were 0.6,0.5,0.4 and 0.3. Figure 3. Under electron microscope and light microscope,more closely conjugation of trageted lipid microbubble ultrasound contrast agents and human lymphatic endothelial cells,were displayed,and located around cells areas and free surface of cell walls.

3 討論

隨著靶向脂質(zhì)微泡制備技術(shù)的不斷發(fā)展，超聲分子顯像技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。超聲分子顯像主要是指經(jīng)靜脈輸入靶向超聲微泡造影劑，在體內(nèi)通過(guò)受體與配體結(jié)合的方式，使靶向造影劑特異性停留于靶組織，應(yīng)用超聲造影技術(shù)來(lái)觀察靶區(qū)在組織水平、細(xì)胞水平的成像，能夠反映病變區(qū)組織在分子基礎(chǔ)方面的變化。近年來(lái)，針對(duì)腫瘤淋巴管和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的超聲分子成像研究逐漸成為熱點(diǎn)[5]。

在實(shí)體腫瘤中，腫瘤細(xì)胞或其他間質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)VEGF-C、VEGF-D，通過(guò)激活VEGFR-3誘導(dǎo)淋巴管生成，增加的淋巴管密度使得腫瘤更容易進(jìn)入淋巴管從而運(yùn)輸?shù)絽^(qū)域淋巴結(jié)。由于腫瘤細(xì)胞的迅速生長(zhǎng)，腫瘤內(nèi)機(jī)械性壓力和滲透壓顯著升高，周圍的淋巴管不易伸入腫瘤組織，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)的淋巴管比周圍的淋巴管稀疏而塌陷。淋巴管新生主要發(fā)生在腫瘤邊緣和周圍，腫瘤中央部缺乏或無(wú)淋巴管。因此，根據(jù)VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信號(hào)通路以及其他信號(hào)通路在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要性，靶向此通路可能阻斷腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[6-7]。

對(duì)于那些不能手術(shù)的患者，通常采取化療方式進(jìn)行治療，阿霉素是常用的腫瘤化療藥物之一，可用于多種腫瘤的治療如肝癌，乳腺癌，軟組織肉瘤等，然而目前臨床應(yīng)用制劑質(zhì)量不穩(wěn)定，且全身用藥毒副反應(yīng)嚴(yán)重，限制了其臨床療效的發(fā)揮。

本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)微泡，可發(fā)揮其穩(wěn)定性好、安全無(wú)毒，易于裝載阿霉素等優(yōu)點(diǎn)；生物素-親和素連接法高效、穩(wěn)定的將載藥微泡與抗人VEGFR-3單克隆抗體相連，使其靶向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞后，可以阻斷VEGFR-3表達(dá)，抑制腫瘤誘導(dǎo)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而在一定程度上能抗腫瘤淋巴管新生和淋巴轉(zhuǎn)移的作用。一定能量超聲波觸發(fā)下，釋放阿霉素瞬時(shí)提高靶組織藥物濃度，一定程度上局部治療淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞，為減少藥物在體內(nèi)的全身毒副反應(yīng)打下基礎(chǔ)[8]。

綜上所述，本研究制備的靶向VEGFR-3的載阿霉素脂質(zhì)微泡超聲造影劑，可以牢固的結(jié)合到淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面，在一定能量超聲波觸發(fā)下，釋放阿霉素瞬時(shí)提高靶組織藥物濃度，對(duì)定位及局部治療腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有重要作用，為進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定較好的基礎(chǔ)。

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