吳亞麗，廖延智，呂艷娜

（廣東輕工職業(yè)技術學院 食品與生物工程系，廣東 廣州 510300）

土壤中蔗髓緩沖包裝材料高效降解菌的篩選與鑒定

吳亞麗，廖延智，呂艷娜

（廣東輕工職業(yè)技術學院 食品與生物工程系，廣東 廣州 510300）

以蔗髓為原料、亞硫酸氫鎂法制漿廢液為膠黏劑制備的蔗髓緩沖包裝材料為研究對象，從土壤中篩選出其高效降解菌株，并進行鑒定，確定菌株的穩(wěn)定性。采用平板水解圈法和失重法進行菌株篩選，同時采用掃描電子顯微鏡（SEM）對蔗髓緩沖包裝材料（BPCPMs）降解前后的形貌進行表征。利用培養(yǎng)特征、形態(tài)學、分子生物學方法進行菌株鑒定。篩選出效果穩(wěn)定的蔗髓緩沖包裝材料高效降解菌株ZS0918，經(jīng)基因鑒定該菌株為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。SEM結果表明，在霉菌作用下，BPCPMs表面出現(xiàn)大小不一的孔洞，材料變薄，發(fā)生顯著降解。

蔗髓緩沖包裝材料；降解菌株；篩選；鑒定

蔗渣是甘蔗糖廠的副產(chǎn)物，是一種來源豐富、成本低廉和環(huán)境友好的可再生纖維資源[1]。蔗渣纖維具有比較優(yōu)良的纖維形態(tài)和結構，是一種優(yōu)良的造紙原料[2]。然而，蔗渣中含有的30%～40%的海綿狀蔗髓影響了漿料質量[3]，所以造紙企業(yè)要將蔗渣經(jīng)過除髓處理后使用[4-5]。我國年產(chǎn)蔗糖600萬噸，絕干蔗渣率約為13%，故每年都將產(chǎn)生約650萬噸絕干蔗渣，250萬噸蔗髓。這些數(shù)量可觀的蔗髓主要被用作燃燒供熱和發(fā)電，經(jīng)濟附加值較低，造成了資源的浪費。另一方面，蔗渣酸性亞硫酸鹽制漿過程產(chǎn)生的蒸煮廢液中含有大量的木素磺酸鹽，是一種具有生物降解性能的天然高分子材料，它具有多種功能團，可作為木材用膠黏劑[6]。觀察發(fā)現(xiàn)蔗髓干燥后具有天然的泡沫結構，這些泡沫體具有一定的彈性和恢復性，有緩沖作用。而以木素磺酸鹽為主要成分的堿性亞硫酸鹽蒸煮廢液的濃縮物具有一定粘結性能，將其作為膠粘劑使用，與具有彈性的蔗髓混合，制備有一定強度和緩沖性能的新型可降解包裝材料，蔗髓緩沖包裝材料，如圖1所示[7]。

圖1　蔗髓緩沖包裝材料（粉碎后）

可降解植物纖維材料的降解方式主要有土壤掩埋法和特定微生物或酶降解法。土壤有微生物的天然培養(yǎng)基之稱，其中存在種類繁多、數(shù)量巨大的微生物，因而土埋試驗是常用的生物降解性能表征手段。在土壤中，試樣被各種微生物侵蝕，逐漸降解并產(chǎn)生的CO2、H2O等小分子產(chǎn)物脫離試樣從而造成試樣失重。由于人工干預較少，土壤掩埋法得到的結果較為貼近實際情況，但是其花費時間長，而且難以測定和定量描述降解情況，故不適用于實驗室測定可降解塑料的降解性能。與此相反，特定微生物或酶降解法試驗條件可以人工控制，能夠清晰反應物質降解的過程和作用機理。

1　實驗

1.1材料

1.1.1樣品

材料：植物纖維廢棄物蔗髓（其主要成分為纖維素30.1%、木質素21.1%、半纖維素32.6%）、加適當?shù)哪z黏劑制造的蔗髓緩沖包裝材料（BPCPMs）。

土壤：曾經(jīng)掩埋過蔗髓緩沖包裝材料（BPCPMs）、并發(fā)生明顯降解的土壤。

1.1.2培養(yǎng)基（w/V）

馴化菌種用培養(yǎng)基：1 000 mL-蔗髓緩沖包裝材料（BPCPMs）10.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO41.0 g，NaCl 1.0 g，(NH4)2SO42.0 g，CaCO32.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，MnCl2·7H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g。

固體培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基中加入 1.5%的瓊脂。

透明圈測定培養(yǎng)基（g/L）[8]：1 000 mL-蔗髓緩沖包裝材料（BPCPMs）10.0 g，KH2PO42.0 g，NH4NO32.0 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，酵母膏5.0 g，瓊脂15.0 g，pH6.5。

鑒定及搖瓶培養(yǎng)用培養(yǎng)基：1 000 mL-蔗髓緩沖包裝材料（BPCPMs）10.0 g，NaNO33.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g。

固體培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。

1.2試劑和儀器

真菌基因組柱式抽提試劑盒、微生物 PCR 裂解液購于上海生工生物工程有限公司；Tris、Na2EDTA·2H2O、瓊脂糖等其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

ZHWY-100B型多振幅軌道搖床；YX-280A型手提式高壓滅菌鍋；DGX-9143B型電熱鼓風干燥箱；DHP-9162型培養(yǎng)箱；XSP-2CA型電子顯微鏡；SHZ-D111型循環(huán)水式真空泵（抽濾機）；MX-101SP1型干式研磨器；3K15型臺式高速離心機；7200型可見分光光度計；PTC0200 PCR儀、044BR3749電泳儀、720BR紫外凝膠成像系統(tǒng)（均購自Bio-RAD Laboratories Inc.）；掃描電子顯微鏡（SEM）。

1.3菌株的分離和篩選

取土樣10.0 g，接入含90 mL馴化培養(yǎng)基的搖瓶中，以BPCPMs粉末作為唯一碳源，于30℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)5 d，用稀釋涂布法涂布鑒定培養(yǎng)基平板（BPCPMs作為唯一碳源）。經(jīng)過 2～5 d的培養(yǎng)，產(chǎn)生水解圈的菌株即BPCPMs降解菌株。將純化后的BPCPMs降解菌株點種到透明圈培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 d后測定菌落及透明水解圈的大小。以水解圈的直徑D和菌落直徑d比值D/d大小作為篩選的標準[9]。將水解圈在平均值以上的菌株進行繼代培養(yǎng)，篩選出D/d值穩(wěn)定的菌株進行搖瓶降解率的測定。

通過電鏡觀察降解后蔗髓包裝材料的內部結構，與降解前原始電鏡圖片進行比較，觀察降解效果。

1.4BPCPMs降解率測定

采用失重法測定BPCPMs的降解率[10]。首先配制BPCPMs液體培養(yǎng)基，分裝到 250 mL三角瓶中，每瓶50 mL，在121℃下進行30 min的高壓滅菌處理，冷卻后待用。在無菌操作條件下，將新鮮的菌種接到配制好的培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫搖床中，150 r/min振蕩培養(yǎng)。經(jīng)過15 d培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)材料明顯減少。抽濾法將搖瓶中未降解的蔗髓分離出來，用蒸餾水洗凈后，置于電熱鼓風干燥箱中于60℃干燥至恒重，用分析天平稱重降解后的質量，計算BPCPMs降解前后的失重率，計算式如式（1）所示。選出降解率最高的菌株，進行酶活曲線測定，并做菌種和基因鑒定。

1.5菌株鑒定

1.5.1形態(tài)及菌落觀察

采用載片培養(yǎng)法進行鏡下形態(tài)觀察，肉眼觀察菌株在真菌鑒定常規(guī)培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征[11]。

1.5.2ITS序列分析

提取真菌基因組DNA。取菌液若干，用真菌基因組柱式抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）抽提基因組DNA。擴增18SrDNA和5.8S rDNA之間的保守序列，其中上游引物序列為TCCGTAGGTGAACCTGCGG，下游引物序列為TCCTCCGCTTATTGATATGC，由上海生工設計合成。20 μL反應體系：模板 DNA 1 μL，PCR Premix 1 μL，dNTP（每種0.2 mmol/L）2 μL，Buffer 1 μL，引物ITS1和ITS2各1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR反應條件：94℃ 3 min，94℃ 0.5 min，52℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。測序由上海生工生物工程有限公司完成。

將測序結果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號，并利用Blast程序搜索同源序列，以Clustal X軟件進行多重序列比對[12]。

2　結果與討論

2.1BPCPMs高效降解菌株的篩選

研究表明，蔗髓中含有大量的半纖維素，是少數(shù)幾種半纖維素含量極高的植物纖維材料之一[13-14]。根據(jù)原料成分分析結果顯示，BPCPMs的主要待降解成份確為半纖維素。對于半纖維素的降解多采用霉菌。本文的降解對象為蔗髓緩沖包裝材料，其主要成份為蔗髓，因此半纖維的降解會很大程度影響材料的降解率。能夠降解半纖維素的菌株，大都對其它的纖維類的成分也有降解作用。因此主要篩選霉菌菌株。

通過馴化培養(yǎng)，平板分離純化，獲得18株霉菌菌株，命名為ZS0901- ZS0918。將這18株菌株接種于BPCPMs分離選擇培養(yǎng)基上進行篩選，根據(jù)根據(jù)水解圈產(chǎn)生時間、清晰度和D/d值大小來初步篩選半纖維素降解菌。結果表明，有5株菌株水解圈產(chǎn)生迅速且清晰，D/d值較大，確定為初篩菌株，為ZS0914、ZS0915、ZS0916、ZS0917、ZS0918。將上述菌劑進行繼代培養(yǎng)，連續(xù)傳代7次后，菌株無論生長狀態(tài)還是D/d值均未有退化現(xiàn)象。將這些菌株用于BPCPMs降解率的測定，選出降解率較高的，初步檢測其酶活特性。

表1　各菌株水解圈

透明圈法適用范圍較廣，適用于多種菌類的分離，是一種較好的分離降解菌的初篩方法。王宜磊等[8]曾用該法分別對細菌、放線菌（主要為鏈霉菌）、霉菌（黑曲霉、青霉、黃曲霉）和大型真菌（彩絨革蓋菌、毛栓菌、金針菇、平菇）進行了研究，結果均能形成明顯的透明圈。透明圈大小不能完全代表降解能力，其原因可能是多方面的。如固體和液體培養(yǎng)條件不同，每一株菌的最佳降解時間和最適降解溫度不可能是一致的，不同菌株具有不同的酶系，所以液體發(fā)酵復篩必不可少。

2.2BPCPMs降解率測定

目前對于植物纖維類材料的可生物降解性缺乏系統(tǒng)的研究，試驗中借鑒塑料材料生物降解評價方法與標準進行BPCPMs的可降解性研究。將5株霉菌菌株通過液體搖瓶培養(yǎng)法處理15 d，采用失重法測定BPCPMs降解率，菌株ZS0918降解率最大，可達60%。

表2　各菌株降解率

將降解后的BPCPMs在60℃下干燥，然后用掃描電鏡，觀察包裝材料降解情況。結果顯示，菌株ZS0918降解效果最明顯。如圖2、圖3所示。

圖2　BPCPMs表面形態(tài)圖片

圖3 BPCPMs降解表面形態(tài)圖片

圖2是BPCPMs未進行降解處理的表面形態(tài)圖，材料表面被膠黏劑所形成的膜覆蓋，致密厚重。經(jīng)過降解處理后，材料變薄，表面被侵蝕出現(xiàn)大小不一的孔洞。由圖2和圖3中可以推斷出，BPCPMs降解是由表層到深層的過程。

比較而言，菌株ZS0918降解率較其它菌株高出很多，且電鏡觀察出降解程度也最明顯。

2.3真菌鑒定

2.3.1形態(tài)及培養(yǎng)特征

菌落特征：毛絨狀，菌落大而疏松，不透明，與培養(yǎng)基結合較牢固，邊緣為白色，里邊為青綠色，生長速度較快，生長時先長出底下的白色菌絲，過1～2天后再慢慢長青綠色菌絲。如圖4所示。

采用載片培養(yǎng)法進行鏡下形態(tài)觀察：菌株ZS0918氣生菌絲長直，透明，菌絲有些有隔膜，無分枝。如圖5所示。菌絲體產(chǎn)生大量的分生孢子梗。分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，垂直生于菌絲體上，膨大形成單排鏈狀孢子，孢子表面光滑、圓形、呈綠色。

圖4　菌落特征觀察

圖5　鏡檢觀察

2.3.2ITS序列分析

對菌株ZS0918的 ITS序列進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，得到500 bp左右長度的序列，在GenBank找到序列登錄號；測序結果利用Blast程序與 GenBank中已登錄的基因序列進行比對，獲得已定名的與之相似的屬、種的相關信息。同源性分析結果顯示（如圖6所示），菌株Aspergillus versicolor與目標菌株ITS序列同源性最高，相似度達到99%，說明它們的親緣關系最為相近。

圖6　基因序列分析

綜合以上培養(yǎng)和形態(tài)特征 ，可以判斷菌株ZS0918為雜色曲霉 Aspergillus candidus。

3　結論

目前國內外報道降解半纖維素和木聚糖的主要菌株中真菌主要是[15]：黑曲霉、黃曲霉，毛殼霉屬，和木霉屬。本實驗篩選的菌株經(jīng)形態(tài)學、分子生物學鑒定：菌株ZS0918為雜色曲霉（Aspergillus candidus），少見報道。且降解率目前可達60%。

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Screening and Identification of BPCPMs Degrading Microorganisms in Soil

WU Ya-li, LIAO Yan-zhi, LV Yan-na

（Dept. of Food, Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300, China）

The screening BPCPMs degrading microorganisms was studied. The methods used to screen the effective strains included hydrolysis spot diameter measurement of hemicellulose plate, weight-loss method, and scanning electron microscope. Methods used to identify the strains included culture characteristics, morphological, physiological-biochemical characteristics and molecular biological methods. Isolated 5 moulds with higher degrading ability. To the best one of degradability, made hemicellulose degrading activity testing from liquid submerged-culture, up to 37.5 U/mL. By molecular biological methods, ZS0918 was Aspergillus versicolor.

bagasse pith cushioning materials; degrading microorganisms; screen; identification

Q935

A

1004-8405(2015)01-0071-06

2015-01-04

廣東高校特色調味品工程技術開發(fā)中心建設項目（GCZX-B1103）；廣東輕工職業(yè)技術學院校級科研項目（KJ201322）。

吳亞麗（1981~），女，講師，碩士；研究方向：生物技術、分析檢測、微生物降解等。ericascut@126.com