周曉芬等

摘要：利用大腸桿菌的原核表達(dá)體系高效表達(dá)SEB基因，獲得了SEB重組蛋白（rSEB）；通過(guò)優(yōu)化SEB較好發(fā)揮免疫效果時(shí)的免疫劑量，選取5 μg/只SEB分別協(xié)同AIV-H9/NDV二聯(lián)滅活苗和AIV-H5滅活疫苗對(duì)2周齡的艾維因肉雞進(jìn)行免疫，定期測(cè)定HA抗體滴度及淋巴細(xì)胞活性以評(píng)價(jià)SEB的免疫增強(qiáng)效果。結(jié)果表明，SEB免疫組的NDV和AIV的HA抗體效價(jià)顯著高于疫苗對(duì)照組（P<0.05），rSEB中劑量組（5 μg/只）佐劑效果明顯（P<0.05）；SEB協(xié)同免疫組的淋巴細(xì)胞活性在免疫后第15 天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，至第25天與疫苗對(duì)照組相比，差異仍然顯著（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：SEB；佐劑；疫苗；肉雞

中圖分類號(hào)：R378.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）17-4245-05

金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的耐熱性腸毒素B（Staphylococcus aureus enterotoxin B，SEB），是引起人類食物中毒和葡萄球菌胃腸炎的常見(jiàn)原因，因此，這方面的研究已成為科學(xué)家們普遍關(guān)注的重要課題。然而，作為一種超抗原，SEB具有強(qiáng)大的淋巴細(xì)胞絲裂原潛力，只需極低濃度（0.1 ng/mL）即可刺激強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，不僅活化大量的T淋巴細(xì)胞，同時(shí)釋放眾多細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α），而且可非特異性提高特異性抗原的免疫原性[1-4]。因此，SEB具備成為免疫佐劑的潛力。有研究發(fā)現(xiàn)，SEB不僅能增強(qiáng)B16F10 黑色素瘤弱抗原的免疫原活性，其效率可達(dá)25倍以上，而且免疫小鼠的保護(hù)率高達(dá)75%以上，保護(hù)期長(zhǎng)達(dá)170 d以上[5]；而且SEB對(duì)T細(xì)胞依賴抗原BSA和HIV-gp120和Ⅱ型T細(xì)胞非依賴抗原——肺炎球菌脂多糖具有非特異性免疫增強(qiáng)作用[6]。在野生型小鼠中，鼻腔內(nèi)給予OVA+SEB能誘導(dǎo)肺部炎癥，重要表現(xiàn)之一是OVA特異性IgE增加[7]。盡管SEB的佐劑活性在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有一定的認(rèn)識(shí)，但目前在國(guó)際獸醫(yī)領(lǐng)域涉足極少，需要做大量的工作。本研究通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)首次研究rSEB作為禽流感疫苗免疫增強(qiáng)劑，通過(guò)檢測(cè)免疫雞群血清中HA抗體水平和外周血淋巴細(xì)胞增殖能力，以此評(píng)價(jià)SEB作為免疫佐劑的效果，為進(jìn)一步深入開發(fā)利用SEB潛力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)菌株pET28a-SEB由本實(shí)驗(yàn)室保存。1日齡非免疫艾維因肉雞購(gòu)自武漢正大有限公司， 飼養(yǎng)至2周齡進(jìn)行隨機(jī)分組隔離飼養(yǎng)管理；禽流感H9+NDV二聯(lián)滅活苗和H5滅活疫苗為黑龍江省生物制品一廠生產(chǎn)；AIV和NDV血凝素抗原從哈爾濱獸藥研究所購(gòu)買；標(biāo)準(zhǔn)SEB（sSEB）及其陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pET28a-SEB表達(dá)質(zhì)粒的鑒定與表達(dá) 將表達(dá)pET28a-SEB的DH5α菌株，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，提取質(zhì)粒DNA，用BamH I和XholI酶切，并將表達(dá)菌株送上海生物工程公司測(cè)序。取測(cè)序正確的pET28a-SEB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），涂布含Amp的LB平板37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物A600 nm為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，收集菌體。經(jīng)超聲波破碎后，離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)。Western Blot檢測(cè)時(shí)，一抗為1∶1 000的SEB陽(yáng)性血清，二抗為1∶5 000兔抗鼠IgG-HRP，顯色為TMB。

1.2.2 pET28a-SEB 包涵體的變性和復(fù)性及純化參考文獻(xiàn)[4]。純化蛋白質(zhì)樣品用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260 nm和OD280 nm值，蛋白質(zhì)含量計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=（1.45×A280 nm-0.74×A260 nm）×稀釋倍數(shù)。將純化物分裝凍干保存，以備動(dòng)物試驗(yàn)。

1.2.3 動(dòng)物試驗(yàn)

1.2.3.1 SEB佐劑效應(yīng)試驗(yàn) 將105只14日齡肉雞隨機(jī)分成7組，每組15只。第1組到第5組肌肉注射AIV-H9/NDV滅活疫苗0.3 mL/只，同時(shí)腹腔注射不同劑量的SEB，其中sSEB試驗(yàn)組設(shè)高、中和低3個(gè)劑量，分別為1.0 μg/只、10 ng/只和1.0 ng/只；rSEB試驗(yàn)組設(shè)置2個(gè)劑量，分別為1.0 μg/只和10 ng/只；第6組肌肉注射AIV-H9/NDV滅活疫苗0.3 mL/只同時(shí)腹腔注射生理鹽水；第7組設(shè)為空白對(duì)照組。

1.2.3.2 rSEB較優(yōu)劑量選擇試驗(yàn) 將90只14日齡肉雞隨機(jī)分成6組，15只/組，前5組肌肉注射AIV-H9/NDV滅活疫苗0.3 mL/只，第6組為空白對(duì)照組。其中第1組到第4組同時(shí)腹腔注射不同劑量的SEB，其中sSEB試驗(yàn)組每只注射1.0 μg標(biāo)準(zhǔn)SEB；rSEB試驗(yàn)組設(shè)置高、中、低3個(gè)劑量組，劑量分別為10.0 μg/只，5.0 μg/只和1.0 μg/只；第5組注射生理鹽水；第6組為空白對(duì)照組。

1.2.3.3 rSEB增強(qiáng)AIV-H5滅活疫苗免疫效果 將60只14日齡艾維因肉雞隨機(jī)分成4組，15只/組。第1至3組肌肉注射AIV-H5滅活疫苗0.3 mL，同時(shí)分別腹腔注射生理鹽水、5.0 μg/只rSEB和pET-28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌裂解物上清液，第4組注射生理鹽水0.3 mL/只為空白對(duì)照組。

1.2.3.4 試驗(yàn)動(dòng)物處理 各試驗(yàn)組在免疫后每天定時(shí)觀察活動(dòng)狀態(tài)，在免疫后第7、14、21和28天翅靜脈采血，進(jìn)行HI試驗(yàn)測(cè)定HA抗體水平；同時(shí)分別收集免疫后第3、5、10、15、20和25天血液淋巴細(xì)胞進(jìn)行MTT試驗(yàn)[8]，測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理測(cè)定結(jié)果以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)分析試驗(yàn)組和對(duì)照組、差異的顯著性，并做相關(guān)性分析。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET8a-SEB的鑒定

由圖1可知，pET28a-SEB經(jīng)BamHI和XholI 雙酶切后，得到大小為750 bp左右的目的片段。核苷酸測(cè)序結(jié)果，目的片段大小為720 bp，與PM36株的SEB基因核苷酸序列同源性達(dá)100%。

2.2 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 和Western Blot檢測(cè)

SDS-PAGE結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化pET28a-SEB質(zhì)粒的BL21（DE3）經(jīng)IPITG誘導(dǎo)后成功地表達(dá)seb基因，重組蛋白分子量約為31 kDa，與預(yù)期結(jié)果一致。重組蛋白主要以包涵體形式存在，其表達(dá)量占沉淀總蛋白42%左右（圖2）；未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌未出現(xiàn)明顯的目的蛋白質(zhì)條帶；而轉(zhuǎn)化pET28a質(zhì)粒的BL21（DE3）無(wú)特異條帶。Western Blot結(jié)果顯示，在約31kDa處出現(xiàn)一條特異性反應(yīng)條帶（圖3），說(shuō)明純化復(fù)性后的rSEB包涵體蛋白質(zhì)能夠被SEB陽(yáng)性血清識(shí)別，其抗原性良好。

2.3 SEB佐劑效應(yīng)試驗(yàn)

各試驗(yàn)組內(nèi)的雞群在免疫前后的采食、活動(dòng)及精神狀態(tài)沒(méi)有明顯變化。對(duì)雞群定期采集血清和分離血液淋巴細(xì)胞，分別進(jìn)行HI和MTT試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)肉雞的體液免疫和細(xì)胞免疫狀態(tài)。表1、表2和表3顯示，sSEB或rSEB免疫組的二者指標(biāo)與免疫劑量呈正相關(guān)，與疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組的結(jié)果相比較，差異顯著（P<0.05）；其中疫苗+1.0 μg/只sSEB組具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，與其他各組差異顯著（P<0.05）；sSEB免疫增強(qiáng)作用比同等劑量的rSEB的作用強(qiáng)。

2.4 rSEB佐劑劑量選擇試驗(yàn)

由表4、表5和表6數(shù)據(jù)顯示，5 μg/只rSEB組在免疫第2周后的抗體水平和淋巴細(xì)胞活性比其他各組同期的結(jié)果都高，而一定劑量sSEB的佐劑作用顯著高于同等劑量rSEB的佐劑效果（P<0.05）；高劑量rSEB（10.0 μg/只）在免疫初期1～2周的HA抗體滴度和淋巴細(xì)胞活性快速提高，但隨后無(wú)明顯變化，低于其他各試驗(yàn)組。

2.5 rSEB增強(qiáng)AIV（H5）滅活疫苗免疫效果

在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，以rSEB+AIV（H5）滅活疫苗免疫組的抗體效價(jià)比AIV（H5）滅活疫苗免疫組的抗體效價(jià)高，二者差異顯著（P<0.05）；AIV（H5）滅活疫苗和PET-28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌裂解物免疫組與疫苗免疫組抗體效價(jià)效價(jià)相當(dāng)，無(wú)明顯差異（表7）。這進(jìn)一步說(shuō)明，SEB在與其他疫苗抗原同時(shí)使用時(shí)起到了免疫增強(qiáng)作用。

3 討論

SEB具有多種生物學(xué)功能[9]，但基于生物安全和食物中毒潛在風(fēng)險(xiǎn)，SEB的實(shí)際應(yīng)用多受限制，尤其是在獸醫(yī)應(yīng)用領(lǐng)域鮮見(jiàn)報(bào)道。許多研究發(fā)現(xiàn)，SEB具有雙相激活作用的機(jī)制，即高劑量時(shí)誘導(dǎo)迅速，隨之出現(xiàn)反應(yīng)不應(yīng)期，而在低劑量時(shí)，則誘導(dǎo)長(zhǎng)期而持續(xù)的激活狀態(tài)[10，11]。在本研究的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)合適的劑量0.01～10 μg rSEB均具有佐劑效應(yīng)，然而過(guò)高劑量的SEB（>10 μg/只）引起了一定程度的免疫抑制。這一現(xiàn)象與其他研究者的結(jié)果基本一致。俞紅等[12]用純化的重組SEB蛋白進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞淋轉(zhuǎn)試驗(yàn)證明，10 μg/mL濃度的SEB刺激淋轉(zhuǎn)的能力最大；當(dāng)濃度達(dá)20 μg/mL或以上時(shí)，淋轉(zhuǎn)受到抑制，且濃度越高，抑制越嚴(yán)重。魏萍[13]研究了SAg-SEB和MDV誘導(dǎo)雛雞與荷瘤小鼠免疫學(xué)變化及細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果也顯示SEB存在雙向激活作用。SEB的雙相作用存在暴露劑量的依賴關(guān)系，可能原因是SAg刺激T細(xì)胞數(shù)量有一閾值存在。

雖然在整個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)過(guò)程并未發(fā)現(xiàn)0.01～10 μg的SEB對(duì)雞群造成肉眼可見(jiàn)病變，但SEB帶來(lái)的生物安全性問(wèn)題不容忽視。國(guó)外早期的研究表明，小鼠給予SEB后導(dǎo)致毒素體內(nèi)分布的峰值出現(xiàn)于1 h之后，至24 h后毒素消失；即使給予BALB/c小鼠SEB100 μg/只，3～4 d后小鼠會(huì)開始恢復(fù)健康[14]。這說(shuō)明SEB在動(dòng)物體內(nèi)停留的時(shí)間不長(zhǎng)，能被快速代謝而降解。盡管還不清楚SEB在肉雞體內(nèi)的代謝規(guī)律，但是有研究者曾研究金黃色葡萄球菌超抗原家屬另一成員SEA在肉雞體內(nèi)的代謝規(guī)律，研究結(jié)果表明肌肉注射200 μg rSEA甚至更高劑量后肉雞并沒(méi)出現(xiàn)明顯異常表現(xiàn)，7 d后檢測(cè)不到SEA殘留[15]。而且關(guān)于SEB對(duì)雞體的病理?yè)p害，國(guó)內(nèi)已有報(bào)道[16]，但其涉及SEB劑量為50 μg/只標(biāo)準(zhǔn)SEB，這一劑量是本試驗(yàn)劑量的10倍以上。將為下一步進(jìn)行SEB對(duì)雞體的毒理和病理試驗(yàn)提供了借鑒。同時(shí)借助SEB-ELISA檢測(cè)試劑進(jìn)一步了解SEB在雞體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)規(guī)律和安全劑量，為安全利用SEB奠定基礎(chǔ)。此外，本試驗(yàn)對(duì)SEB結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理改造，減少甚至消除其毒副作用，充分發(fā)揮其超抗原優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)其在獸醫(yī)科學(xué)上應(yīng)用領(lǐng)域。

試驗(yàn)結(jié)果表明，適量SEB具有良好的佐劑活性，不僅能協(xié)助禽流感和新城疫等免疫抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生快且強(qiáng)的體液免疫，同時(shí)也能激活細(xì)胞免疫，進(jìn)而增強(qiáng)雞體抗病能力。適量rSEB作為強(qiáng)有力的T細(xì)胞激活抗原，具有強(qiáng)大的佐劑潛力，如能合理利用其超抗原優(yōu)勢(shì)，SEB在預(yù)防獸醫(yī)領(lǐng)域?qū)⒕哂兄匾拈_發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

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