張喜峰，羅光宏，王春暉*

（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000；2.河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開發(fā)中心，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅張掖734000）

大孔樹脂法分離純化鎖陽(yáng)總黃酮

張喜峰1，羅光宏2，王春暉1*

（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000；2.河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開發(fā)中心，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅張掖734000）

為了分離、純化鎖陽(yáng)總黃酮，比較了5種大孔樹脂的靜態(tài)吸附過程，篩選出了適合分離鎖陽(yáng)總黃酮的樹脂。結(jié)果表明，AB-8樹脂對(duì)鎖陽(yáng)總黃酮有較好的分離純化效果，其吸附過程可用Langmuir和Freundlich吸附等溫式來(lái)描述；吸附條件：溶液質(zhì)量濃度3.9 mg/mL，pH值為5，吸附體積5 BV，流速2 BV/h，溫度25℃；洗脫條件：體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇洗脫體積5 BV，體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗脫體積10 BV，流速2 BV/h，鎖陽(yáng)總黃酮純度由9.83%升高至67.8%，其回收率為84.02%。因此，AB-8大孔樹脂較適合分離純化鎖陽(yáng)總黃酮。

總黃酮；大孔樹脂；鎖陽(yáng)；分離純化

鎖陽(yáng)（Cynomorium songaricumRupr.）是鎖陽(yáng)科鎖陽(yáng)屬的單科單屬單種植物，多寄生于蒺藜科（Zygophyllaceae）白刺屬（NatrariaL.）植物根部，是全寄生種子植物［1］。主要產(chǎn)于甘肅、新疆、青海、內(nèi)蒙古等干旱沙漠地帶［2］。研究表明，鎖陽(yáng)在防癌、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、防治心血管疾病、治療白細(xì)胞減少等方面也具有重要醫(yī)療價(jià)值［3］。近年來(lái)，鎖陽(yáng)系列產(chǎn)品的研究開發(fā)已取得突破性進(jìn)展，涉及到醫(yī)藥、食品、發(fā)酵等各個(gè)方面：鎖陽(yáng)沖劑、鎖陽(yáng)膠囊、鎖陽(yáng)精、鎖陽(yáng)茶、鎖陽(yáng)飲片等，尤其是鎖陽(yáng)保健酒、鎖陽(yáng)啤酒、鎖陽(yáng)保健飲料和鎖陽(yáng)口服液的生產(chǎn)已實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。鎖陽(yáng)黃酮類化合物主要為兒茶素（catechin）、柑桔素4′-0-吡喃葡萄糖及一種以柑桔素為苷元的配糖體。研究表明，黃酮類化合物有明顯的抗?jié)儭⒖咕?、抗炎、降血脂等藥用保健功能，能有效地清除自由基和脂質(zhì)過氧化物，是一種具有廣泛開發(fā)前景的天然抗氧化劑［4-6］。黃酮的分離純化大多采用固-液萃?。?］、液-液萃?。?］、柱層析和高速逆流色譜等［9-11］，這些方法存在效率低、周期長(zhǎng)、無(wú)法用于工業(yè)大批量生產(chǎn)等問題。大孔樹脂利用樹脂與生物物質(zhì)分子之間相互作用力，實(shí)現(xiàn)生化物質(zhì)與大量雜質(zhì)分離，采用適當(dāng)洗脫劑進(jìn)行洗脫過程［12］，大孔樹脂可重復(fù)利用，成本較低。

本實(shí)驗(yàn)是在篩選適宜的大孔樹脂基礎(chǔ)上，采用靜態(tài)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)摸索鎖陽(yáng)黃酮分離純化的最適條件，為鎖陽(yáng)深加工提取理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鎖陽(yáng)由甘肅省微藻技術(shù)研發(fā)中心提供；選用鎖陽(yáng)（Cynomorium songaricum）的干燥肉質(zhì)莖，樣品于50℃干燥至質(zhì)量恒定，粉碎，過40目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

蘆丁對(duì)照品（純度≥98%），No.100080-200306：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。NKA-9、NKA、D101、AB-8、HPD-750型大孔樹脂5種樹脂型號(hào)與特性見表1。

表1　大孔樹脂的物理特性Table 1 Physical properties of macroporous resins

1.2儀器與設(shè)備

SP-721分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器：河南鞏義金華儀器有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵：深圳市瑞鑫達(dá)化玻儀器有限公司；BSD-YF2200立式雙層智能精密型搖床：上海西箭儀器設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1黃酮粗提物制備

稱取一定量鎖陽(yáng)粉末，按照1∶50（g∶mL）料液比加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，在60℃浸提2 h，3 000 r/min離心5 min，將上清液減壓濃縮、干燥后備用。

1.3.2總黃酮含量的測(cè)定

總黃酮含量的測(cè)定采用分光光度法。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：稱取一定量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液配制成黃酮質(zhì)量濃度為1 mg/mL的乙醇溶液。分別精確吸0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6 mL于6個(gè)10 mL于棕色容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，混勻靜置6min，再加入10%硝酸鋁0.3mL，搖勻，靜置6 min，再加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%氫氧化鈉溶液，用水定容至刻度，靜置15 min，以試劑空白作參照，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光度值［13］，以蘆丁含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=1.245x-0.002 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.3.3樹脂的預(yù)處理

用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡5種樹脂（NKA-9、NKA、D101、AB-8、HPD-750），傾去上浮的雜質(zhì)，先用1 mol/L HCl浸泡12 h，用蒸餾水去酸，然后用1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，用蒸餾水去堿，抽濾，得抽干樹脂。

1.3.4不同樹脂靜態(tài)吸附量、解吸量和解吸率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取抽干的5種樹脂各1 g。分別加入5.37 mg/mL鎖陽(yáng)黃酮水溶液50 mL，置于25℃恒溫?fù)u床以150 r/min振蕩24 h，測(cè)定鎖陽(yáng)黃酮含量，分別按式（1）計(jì)算各種樹脂室溫條件下的靜態(tài)吸附量。再向已吸附完全的5種樹脂分別加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，以150 r/min搖床解吸12 h后，測(cè)定鎖陽(yáng)總黃酮質(zhì)量濃度，再根據(jù)式（2）、（3）計(jì)算解吸量和解吸率。最后選擇適合吸附鎖陽(yáng)黃酮的樹脂。

式中：Qe為吸附量，mg/g；C0為初始質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce為平衡質(zhì)量濃度，mg/mL；Vi為加入的原液體積，mL；W為樹脂用量，g；Qd為解吸量，%；D為解吸率，%；Cd為洗脫液質(zhì)量濃度，mg/mL；Vd為洗脫液體積，mL。

1.3.5吸附液pH值的選擇

準(zhǔn)確稱取抽干的樹脂1g于三角瓶中，分別加入不同pH值的鎖陽(yáng)黃酮溶液，測(cè)定鎖陽(yáng)總黃酮的靜態(tài)吸附量，選擇適合上樣的pH值。

1.3.6靜態(tài)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

將篩選的1 g樹脂于三角瓶中，加入30 mL 5.37 mg/mL鎖陽(yáng)黃酮水溶液，置于25℃恒溫?fù)u床150 r/min振蕩12 h，每隔1 h測(cè)其總黃酮含量，利用式（4）計(jì)算吸附量，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.7大孔樹脂吸附等溫線的制作

分別稱取預(yù)處理后樹脂1 g于三角瓶中，依次加入不同質(zhì)量濃度的鎖陽(yáng)黃酮溶液，分別在不同溫度（25℃、30℃、35℃）搖床振蕩150 r/min。待吸附飽和后，測(cè)其鎖陽(yáng)總黃酮的質(zhì)量濃度，計(jì)算其靜態(tài)吸附量；以樹脂吸附量和吸附平衡液相總黃酮質(zhì)量濃度作圖，繪制不同溫度條件下吸附等溫線。用Langmuir公式和Freundlich［14］公式對(duì)鎖陽(yáng)總黃酮的吸附等溫線進(jìn)行擬合。

Langmuir等溫方程：

Freundlich等溫方程：

式中：Qe為吸附量，mg/g；Ce為平衡質(zhì)量濃度，mg/mL；Qm為每克濕樹脂的最大吸附量，mg/g；KL為吸附平衡常數(shù)；KF、n為常數(shù)。

1.3.8大孔樹脂對(duì)鎖陽(yáng)總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附、解吸實(shí)驗(yàn)

取所選樹脂濕法裝柱（17mm×120mm），樹脂的柱體積（bed volume，BV）為10 mL，鎖陽(yáng)總黃酮提取液以2.0 BV/h流速通過吸附柱，每隔1 BV測(cè)定流出液中總黃酮的質(zhì)量濃度，繪制泄露曲線。上樣結(jié)束后用蒸餾水沖洗，以便洗下樹脂中未結(jié)合的的雜質(zhì)。然后采用不同質(zhì)量濃度的乙醇溶液以2.0 BV/h的速度洗脫層析柱，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮純度，計(jì)算回收率。計(jì)算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1樹脂靜態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1不同樹脂吸附量、解吸量和解吸率的測(cè)定

表2　不同樹脂的靜態(tài)吸附與解吸特性比較Table 2 Comparison of static adsorption and desorption characteristics of different resins

由表2可知，D101、AB-8和HPD-750型樹脂的吸附效果較好，吸附量分別96.9 mg/g、98.6 mg/g和84.3 mg/g。但D101、HPD-750的解吸量和解吸率較低，說(shuō)明樹脂與鎖陽(yáng)總黃酮結(jié)合能力較強(qiáng)，不利于總黃酮的洗脫；因此，選用AB-8大孔吸附樹脂來(lái)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2pH值對(duì)吸附的影響

圖1　鎖陽(yáng)黃酮溶液pH值對(duì)吸附量的影響Fig.1 Effect of pH on the adsorption capacity

由圖1可知，酸性條件易于鎖陽(yáng)黃酮的吸附。其原因可能是黃酮類化合物酚羥基在酸性條件下未解離，主要以范德華力與樹脂進(jìn)行物理吸附。而在堿性條件下，以黃酮類化合物可能以解離形式存在，與樹脂吸附較難，因此選擇黃酮溶液pH值為5。

2.1.3AB-8大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)過程

由圖2可知，隨著時(shí)間逐漸增加，AB-8樹脂對(duì)鎖陽(yáng)黃酮吸附量逐漸上升，當(dāng)吸附時(shí)間為6 h時(shí)，吸附達(dá)到最大值［15］，隨后鎖陽(yáng)黃酮吸附量趨于平衡。因此AB-8大孔吸附樹脂的靜態(tài)平衡吸附時(shí)間為6 h。

圖2　AB-8大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附黃酮?jiǎng)恿W(xué)曲線Fig.2 Adsorption kinetics curve for the total flavonoids on AB-8 resin

2.1.4AB-8大孔吸附樹脂吸附等溫線的測(cè)定

分別在3種不同溫度下測(cè)量AB-8樹脂在不同質(zhì)量濃度鎖陽(yáng)黃酮溶液中（2.2 mg/mL、2.6 mg/mL、3.2 mg/mL、3.9 mg/mL、4.5 mg/mL）的吸附量，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在質(zhì)量濃度恒定條件下，溫度升高，吸附量反而降低，說(shuō)明低溫條件利于進(jìn)行吸附；因此，在實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)室溫更有利于吸附的進(jìn)行。當(dāng)鎖陽(yáng)黃酮質(zhì)量濃度為3.9 mg/mL時(shí)，AB-8樹脂對(duì)鎖陽(yáng)黃酮吸附效果較好。所以后續(xù)試驗(yàn)選擇鎖陽(yáng)黃酮質(zhì)量濃度為3.9 mg/mL上樣。

圖3　不同溫度下AB-8吸附水溶液中鎖陽(yáng)總黃酮的吸附等溫線Fig.3 Adsorption isotherms of the total flavonoids fromC.songaricum in AB-8 resin aqueous solution at different temperature

吸附等溫線是表征不同物質(zhì)吸附的特征曲線，Langmuir方程建立在單分子吸附基礎(chǔ)上，而Freundlich方程可闡述單層和多層吸附行為［16］。將不同溫度條件下測(cè)量AB-8樹脂在不同質(zhì)量濃度鎖陽(yáng)黃酮溶液中的吸附量，采用Langmuir和Freundlich方程擬合曲線，得到的方程參數(shù)見表3。

表3　兩種模型方程擬合結(jié)果及參數(shù)Table 3 The fitting results and parameters of two model equation

由表3可知，Langmuir相關(guān)系數(shù)R2比Freundlich相關(guān)系數(shù)要高，并且在25℃達(dá)到0.997 3，說(shuō)明Langmuir模型更適用于分析AB-8樹脂吸附鎖陽(yáng)黃酮。在Freundlich方程中1/n的值在0.1～0.5范圍內(nèi)時(shí)，吸附較易進(jìn)行，從表3可知，AB-8樹脂吸附鎖陽(yáng)黃酮時(shí)的1/n值為0.3～0.5之間，說(shuō)明該吸附反應(yīng)較易進(jìn)行。

2.2樹脂動(dòng)態(tài)泄露曲線的測(cè)定

檢測(cè)了AB-8大孔樹脂的動(dòng)態(tài)泄露曲線，每1 BV檢測(cè)一次流出液中的黃酮含量。由圖4可知，當(dāng)流出液在6 BV之內(nèi)，流出液中無(wú)黃酮露出，當(dāng)流出液為8 BV時(shí)，流出液中黃酮含量快速增加。所以選擇最佳上樣體積為5 BV。

圖4　AB-8吸附鎖陽(yáng)黃酮的動(dòng)態(tài)泄露曲線Fig.4 Dynamic breakthrough curves of total flavonoids from C.songaricumby AB-8 resin

2.3AB-8樹脂動(dòng)態(tài)解吸的測(cè)定

AB-8樹脂濕法裝柱，在最佳條件下上柱，先用5 BV蒸餾水以2 BV/h的體積流量除雜至流出液為無(wú)色，再依次用5 BV和10 BV一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇以2 BV/h的體積流量上柱洗脫，收集各洗脫液，檢測(cè)其中總黃酮含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。由表4可知，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫液上柱洗脫時(shí)，總浸膏量較多，但總黃酮不存在，說(shuō)明總黃酮與樹脂之間吸附能力較強(qiáng)，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為60%～70%乙醇洗脫時(shí)，總黃酮純度較高。因此采用蒸餾水沖洗后，收集60%～70%的乙醇洗脫部分。

表4　不同洗脫劑對(duì)總黃酮解吸的影響Table 4 Effect of different eluent on the desorption of total flavonoids

2.4最佳工藝穩(wěn)定性試驗(yàn)

取3.9 mg/mL的鎖陽(yáng)黃酮粗提液，以2 BV/h流速上樣，后續(xù)采用5 BV蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇沖洗雜質(zhì)，采用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇5 BV洗脫，再用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇10 BV洗脫，測(cè)定洗脫液中總黃酮含量，濃縮干燥，計(jì)算浸膏中總黃酮回收率。結(jié)果顯示鎖陽(yáng)總黃酮純度由9.83%升高至67.8%，其回收率為84.02%。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)考察5種大孔吸附樹脂對(duì)鎖陽(yáng)總黃酮進(jìn)行靜態(tài)吸附、解吸篩選，結(jié)果表明AB-8樹脂具有較好靜態(tài)吸附及解吸效果。純化條件為取質(zhì)量濃度為3.9 mg/mL的鎖陽(yáng)黃酮粗提水溶液150 mL，2 BV/h流速上樣，體積5 BV；吸附平衡后，5 BV蒸餾水和5 BV體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇沖洗雜質(zhì)；采用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇5 BV洗脫，再用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇10 BV洗脫，收集洗脫液濃縮、干燥，鎖陽(yáng)黃酮提取液中總黃酮的純度由9.83%升高至67.8%，其回收率為84.02%。而張庭瑞等［17］采用AB-8樹脂純化鎖陽(yáng)總黃酮時(shí)僅用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗脫，回收率為64.88%。研究結(jié)果表明了AB-8大孔樹脂對(duì)鎖陽(yáng)總黃酮是實(shí)際可行的，可為鎖陽(yáng)總黃酮大規(guī)模純化提供理論依據(jù)。

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Separation and purification of total flavones fromCynomorium songaricumby macroporous resins macroporous resins

ZHANG Xifeng1，LUO Guanghong2，WANG Chunhui1*
（1.College of Agriculture and Biotechnology，Hexi University，Zhangye 734000，China；2.Microalgae Engineering Research Center of Gansu Province，Kaiyuan Bio-Tech Development Center，Hexi University，Zhangye 734000，China）

In order to isolate and purify the total flavonoids fromCynomorium songaricum，comparing with static adsorption process of 5 kinds of macroporous resins，and the suitable resin was determined.The results showed that AB-8 resin was the optimal due to its highest separation and purification of the total flavonoids fromC.songaricumand its adsorption process could be described by the Langmuir and Freundlich isotherms.The optimum adsorption conditions were solution concentration 3.9 mg/ml，pH 5.0，adsorbed volume 5 BV，flow velocity 2 BV/h，temperature 25℃.The optimum elution conditions were 60%ethanol 5 BV，70%ethanol 10 BV，flow velocity 2 BV/h.Under this condition，the content ofC.songaricum total flavonoids increased from 9.83%to 67.8%，and the recovery rate was 84.02%.AB-8 resin was suitable for the separation and purification of the total flavonoids fromC.songaricum.

total flavonoids；macroporous resins；Cynomorium songaricum；separation and purification

S567.9

A

0254-5071（2015）10-0106-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.024

2015-09-02

河西學(xué)院科研創(chuàng)新與應(yīng)用校長(zhǎng)基金項(xiàng)目（No.XZ2014-29）；甘肅省中小企業(yè)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（1047GCCG001）

張喜峰（1982-），男，講師，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化。

王春暉（1977-），男，講師，本科，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。