陳仕學(xué)，聶文丹，秦志亮，鐘　新

（銅仁學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院；梵凈山特色動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；應(yīng)用化學(xué)研究所，貴州 銅仁 554300 ）

基于微波輔助提取八角蓮黃酮類化合物的工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

陳仕學(xué)，聶文丹，秦志亮，鐘新

（銅仁學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院；梵凈山特色動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；應(yīng)用化學(xué)研究所，貴州 銅仁 554300 ）

采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)梵凈山野生八角蓮中黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行研究，主要考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波時(shí)間及微波功率4個(gè)因素對(duì)提取率的影響，結(jié)果表明：微波輔助提取的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1：30、微波時(shí)間4min和微波功率中低火（264w），黃酮類化合物的提取率為9.038%。另外，八角蓮黃酮類化合物對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基、鄰苯三酚自氧化反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基和豬油有較高的清除能力。因此，采用微波輔助浸提法具有時(shí)間短、耗能少、含量高及抗氧化作用等特點(diǎn)。

八角蓮；黃酮類化合物；微波提??；工藝優(yōu)化；抗氧化性

1.引言

八角蓮（Dysosma versipellis （Hance） M. Cheng ex Ying），小檗科八角蓮屬植物，湖北、貴州、廣東、等地方分布有大量該物質(zhì)［1］，并有清除自由基和抗氧化活性作用［2，3］。到目前為止，對(duì)梵凈山八角蓮沒有研究報(bào)道。本文以梵凈山野生八角蓮為原料，通過微波方法提取并開展抗氧化性研究，為開發(fā)本地藥用材料打基礎(chǔ)。

2.器材與方法

2.1.材料

梵凈山野生八角蓮，60℃烘干，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.試劑

Al（NO3）3、 FeSO4、H2O2；無(wú)水乙醇、冰醋酸Na2S2O3、三氯甲烷；NaOH；NaNO2、乙酸乙酯；水楊酸；鹽酸；Tris；鄰苯三酚。

2.3.儀器

恒溫干燥、MM823EC8-PS（X）型美的微波爐、800型低速離心機(jī)、AR1140型電子天平、粉碎機(jī)、分光光度計(jì)。

2.4.方法

2.4.1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取10mg蘆丁，30%乙醇溶液溶解，用容量瓶定溶到100mL刻度，攪拌均勻，得到0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 于10mL容量瓶中，加5g/100mL亞硝酸鈉1.0mL，放置5min，加10g/100mL硝酸鋁1.0mL，放置5min，再加4g/100mL氫氧化鈉5mL，搖勻，放置10min，定容 100mL。用質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo)，吸光度作縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線［4］。

2.4.2.含量測(cè)定。

稱取藥材粉，溶解加熱提取，濾液倒入100mL容量瓶，在瓶中加入1.0mL 5%的亞硝酸鈉溶液，放置一會(huì)兒；加1.0mL 10%硝酸鋁溶液，放一會(huì)兒，再加 5.0mL 4%L氫氧化鈉溶液，然后用蒸餾水加到100mL，震蕩，放10min測(cè)定，計(jì)算該物質(zhì)含量。

2.4.3.提取條件的優(yōu)化

2.4.3.1.單因素實(shí)驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取已處理好的八角蓮粉末 1.0000g，以乙醇為浸提劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)，料液比1：10，1：20，1：30，1：40，1：50；微波時(shí)間3、4、5、6、7、8min；乙醇濃度20%、30%、40%、50%、60%；功率設(shè)置為低火、中低火、中火、中高火、高火做單因素試驗(yàn)。

2.4.3.2.正交試驗(yàn)

由于各單因素影響不同，因此需對(duì)單因素通過正交試驗(yàn)得到最佳浸提條件。

2.4.4.抗氧化活性研究

2.4.4.1.?OH自由基清除率的測(cè)定［5］

取7個(gè)25mL容量瓶編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7。依次加入2mmol/LFeSO4溶液5mL、6mmol/L水楊酸-乙醇15mL。向1號(hào)加2mL蒸餾水，向2-7號(hào)分別加濃度不同的2mL黃酮類化合物，然后在1-6號(hào)中加5mL 3%雙氧水，7號(hào)加5mL蒸餾水，40℃水浴加熱25min。測(cè)吸光度。

清除率（%）=（A0—（Ax—Ax0））/A0×100%，式中：A0表示空白吸光度；Ax表示加待測(cè)溶液后的吸光度；Ax0表示待測(cè)溶液本底吸光值。

2.4.4.2.·O2-清除率的測(cè)定

取7個(gè)50mL容量瓶編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7。依次加入0.05mol/LTris-HCl 5mL，37℃水浴加熱20min。1號(hào)加2mL蒸餾水，2到7號(hào)分別加入濃度不同樣品溶液 2mL，1-6號(hào)加 3mmol/L鄰苯三酚0.5mL，7號(hào)加入0.01mL/L 鹽酸0.5mL，將1-7號(hào)同時(shí)放于37℃水浴加熱6min，加入0.1mol/L鹽酸1mL，在320nm處測(cè)其吸光值［6-7］。

清除率（%）=（A0-（Ax-Ax0））/A0×100%，式中：A0表示空白吸光度；Ax表示加待測(cè)溶液后吸光度；Ax0表示待測(cè)溶液本底吸光值。

2.4.4.3.POV值的測(cè)定

取1mL豬油于250mL碘量瓶中，加入不同體積的黃酮類化合物提取液，于 60℃恒溫干燥箱保溫48h，取出加入氯仿-冰乙酸（2：3）混合液20mL，震蕩，加1mL飽和碘化鉀使之溶解，震蕩均勻，密封、暗處保存 5min，立刻加蒸餾水 25mL，搖均勻，Na2S2O3滴至淡黃色，加1mL 1%淀粉作指示劑，至藍(lán)色消去，記錄體積 V1，同法作空白實(shí)驗(yàn)，消耗Na2S2O3體積為V0［8］，計(jì)算POV值。

式中：V1表示樣品消耗 Na2S2O3的體積（mL）；V2表示空白消耗Na2S2O3的體積（mL）；M：1mL豬油的質(zhì)量（1mL豬油相當(dāng)于0.6g）。

3.結(jié)果與分析

3.1.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

由2.4.1.的方法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.084C-0.004（R2=0.999），二者呈良好的線性關(guān)系（見圖1）。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

提取率Y（%）=C×V/M，

式中：Y表示提取率（%）；C表示待測(cè)樣含量（mg/mL）；V為提取液的體積（mL）；M為樣品質(zhì)量（g）。

3.2.單因素實(shí)驗(yàn)

3.2.1.乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

由圖 2不難看出，開始時(shí)提取率與體積分?jǐn)?shù)關(guān)系變化不大，到 40%時(shí)，提取率為最高值，以后隨之下降。原因是與微波作用原理有一定關(guān)系，即是增加乙醇體積分?jǐn)?shù)可以使原料充分溶解；但是乙醇體積分?jǐn)?shù)如果太高，又會(huì)使細(xì)胞內(nèi)醇溶性雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致提取率下降［9］。因此，選擇40%作為最佳條件。

3.2.2.料液比的影響

由圖3看出，開始料液比增大提取率緩慢增加，到達(dá)1：30的時(shí)候提取率為最大，大于1：30，會(huì)逐漸降低。是因?yàn)榱弦罕燃哟罄谟行С煞殖浞秩艹觯M(jìn)而提高了得率，比例加大反而使細(xì)胞不能完全破裂，不能充分溶出有效成分，綜合考慮［10］，選擇1：30作為最佳值。

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

圖3　料液比的影響

圖4　浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖5　功率的影響

3.2.3.浸提時(shí)間的影響

由圖 4得到，隨著時(shí)間加長(zhǎng)，提取顯著加大，5min時(shí)，達(dá)最佳值，并隨時(shí)間加長(zhǎng)反而降低，可能原因是時(shí)間短，微波作用不全，有效成分溶出不多，導(dǎo)致得率也不高，總黃酮得率也相應(yīng)提高，但隨著時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，細(xì)胞膜破碎，從而影響提取效果［11-12］。另外，時(shí)間長(zhǎng)，溫度會(huì)上升，使有效成分遭到破壞并分解［13-14］，因此，應(yīng)選擇5min為最佳時(shí)間。

3.2.4.功率的影響

由圖5得知，隨著功率加大，提取率有所增加，在264w時(shí)，提取率為最大值，并隨著功率加大而降低，若要達(dá)到相應(yīng)的提取率，采用低火加熱時(shí)需要較長(zhǎng)的微波輻射時(shí)間，采用中火加熱，十分容易爆沸，嚴(yán)重影響提取效果［15］。因此，選擇264w為最佳值。

3.3.正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

由于各因素影響不一，為了更好確定影響情況，對(duì)各單因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到最佳提取工藝，結(jié)果見表1和表2。

由表2得到，對(duì)其影響因素順序是D＞A＞B＞C，因此得到最優(yōu)條件是A2B2C1D2，即體積分?jǐn)?shù)40%、1：30為料液比、4min為最佳浸提時(shí)間、功率為中低火（264w）。

3.4.驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)最佳工藝條件是否穩(wěn)定，利用最佳工藝條件重復(fù)操作5次，測(cè)提取率，計(jì)算RSD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。

由表 3得出，黃酮類化合物平均提取率為9.038%，比正交試驗(yàn)中的最佳值均大，計(jì)算得出RSD 為0.68%，由此表明該提工藝是比較穩(wěn)定的。

3.5.不同產(chǎn)地八角蓮黃酮類化合物的提取率比較

分別稱取不同產(chǎn)地八角蓮1g在最佳條件下提取黃酮類化合物，測(cè)定吸光值，通過回歸方程計(jì)算提取率，結(jié)果見表4。由表4得到，產(chǎn)地不同，其提取率有一定差異，且梵凈山野生八角蓮黃酮類化合物提取率比其他地方的稍微較高。

3.6.抗氧化性研究

3.6.1.羥基自由基清除

由圖 6可知，該化合物對(duì)羥基自由基有一定清除作用，隨著濃度的增加清除作用也增大。

表1　因素水平表

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表 4 不同產(chǎn)地八角蓮黃酮類化合物的提取率比較

圖6　八角蓮黃酮類化合物?OH自由基的清除能力

3.6.2.超氧陰離子的清除

由圖 7可知，鄰苯三酚在堿性情況下自氧化迅速，放出·O2-，當(dāng)加清除劑后容易清除·O2-，使得鄰苯三酚自氧化速度顯著降低。由此看出，該文章對(duì)鄰苯三酚自氧化有很好抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用加大。

圖7　八角蓮黃酮類化合物對(duì)·O2-的清除能力

3.6.3.POV值測(cè)定

由圖8可知，隨該物質(zhì)含量增加POV值逐漸減小，POV值小對(duì)豬油有氧化抑制作用，POV值越小對(duì)豬油有氧化抑制有增強(qiáng)的趨勢(shì)。初期趨勢(shì)明顯，隨后趨勢(shì)越小，總之，該物質(zhì)對(duì)豬油有極好的抗氧化活性。

圖8　POV值測(cè)定

4.結(jié)論

通過正交分析得出最佳工藝條件：乙醇濃度30%，料液比1：40g/mL，最佳時(shí)間4min，功率264w。此條件下，對(duì)貴州不同產(chǎn)地八角蓮黃酮類化合物提取，其提取率有所差異，梵凈山的稍偏高；并檢驗(yàn)抗氧化活性，結(jié)果為：八角蓮黃酮類化合物對(duì)·OH 和·O2-均具有清除作用，通過測(cè)定 POV值，得知對(duì)豬油氧化有抑制作用，并與含量有關(guān)系。

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Study on Microwave Extraction Process Optimization and Anti-oxidative Activity of Flavones from The Wild Dysosma Versipellis

CHEN Shi-xue，NIE Wen-dan，QIN Zhi-liang，ZHONG Xin
（School of Material and Chemical Engineering，Tongren University； Key Laboratory of Special Animal and Plant Resource in Fanjing Mountain； Institute of Applied Chemistry，Tongren，Guizhou 554300，China ）

The extraction conditions were approached by single factor and orthogonal test for the flavonoids from Dysosma versipellis. The results showed that the optimum extracting conditions were ethanolvolume fraction 40%，solid -liquid ratio 1：30 g/mL，microwave time 4min and microwave power 264w. The flavonoids yield reached 9.038%. In addition，the flavonoids of Dysosma versipellis could scavenge hydroxyl free radical formed in Fenton reaction，Oxygenfree radicals of self oxidation of pyrogallol and lard. Therefore，microwave assistance could be in possession of shorter time，lower energy. Improving efficiency and the oxidation resistance was stronger and high removal capacity of flaovues from Dysosma versipellis.

Dysosma versipellis，flavonoids，microwave extraction，process optimization，anti-oxidative activity

O652

A

1673-9639 （2015） 04-0019-05

（責(zé)任編輯 徐松金）（責(zé)任校對(duì) 毛志）（英文編輯 田興斌）

2015-06-22

本文系貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合LH字［2014］7493），銅仁學(xué)院院級(jí)學(xué)生項(xiàng)目（trxyS1351），貴州省教育廳基金項(xiàng)目“梵凈山特色動(dòng)植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)支持學(xué)科”（黔教合KY（2011）005）成果。

陳仕學(xué)（1976-），女，貴州銅仁人，副教授，碩士，研究方向：生化分離及天然藥物研究。