王斌 王小琴

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔科，太原 030001

牙周炎是影響口腔健康的重要疾病，其致病機(jī)制除了細(xì)菌的直接侵入，細(xì)菌毒素及代謝產(chǎn)物也可破壞牙周組織，引起炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì)。阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是表現(xiàn)為睡眠時(shí)嚴(yán)重打鼾，呼吸暫?；虮餁獠?huì)引起各重要器官、系統(tǒng)功能改變的一種疾病。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，牙周炎和OSAHS有密切關(guān)系[1-2]。牙周炎患者中白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-18和低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α的表達(dá)明顯升高[3-4]；而OSAHS患者血清中IL-18水平也明顯高于正常人群，且隨著疾病嚴(yán)重程度的增加而增加[5]。有實(shí)驗(yàn)[6]發(fā)現(xiàn)，慢性間歇低氧誘發(fā)了HIF-1α表達(dá)升高，而慢性間歇低氧是OSAHS的一個(gè)顯著特征，由此推斷，IL-18、HIF-1α與牙周炎和OSAHS可能存在某種聯(lián)系。目前關(guān)于牙周炎和OSAHS的研究還較少，本研究通過建立模擬OSAHS的間歇低氧條件下的大鼠牙周炎模型，觀察IL-18和HIF-1α在血清和牙齦組織中的表達(dá)，探討牙周炎和OSAHS發(fā)病相關(guān)的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器 水合氯醛，大鼠IL-18酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、大鼠HIF-1α ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。動(dòng)物間歇低氧倉（山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院），測(cè)氧儀（浙江電化分析儀器廠）；醫(yī)用氧氣（太原市欣易得氣體廠）和高純度氮?dú)猓ū狈綒怏w有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5周齡健康雄性SD大鼠32只，質(zhì)量（200±20） g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及建模 將32只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，節(jié)律性光照，用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4組：常氧對(duì)照組（A組）、常氧牙周炎組（B組）、低氧對(duì)照組（C組）、低氧牙周炎組（D組），每組8只，分籠飼養(yǎng)。A組：普通飼料喂養(yǎng)。B組和D組：10%的水合氯醛腹腔麻醉后，用0.2 mm的結(jié)扎絲結(jié)扎于大鼠雙側(cè)上頜第二磨牙牙頸部，盡量置于齦溝內(nèi)，每周檢查一次結(jié)扎絲，如有脫落應(yīng)再行結(jié)扎；1周內(nèi)逐漸增加高糖食物比例直至完全代替普通飼料，每日用高糖粉質(zhì)飼料喂養(yǎng)。C組和D組：參考杜曉燕等[7]的方法，將大鼠放入間歇低氧艙內(nèi)，每天缺氧時(shí)間為8 h。在實(shí)驗(yàn)期間，氮?dú)夂脱鯕庠陔姶砰y的控制下循環(huán)輸入低氧艙，每個(gè)循環(huán)為90 s，通過測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)低氧艙內(nèi)的氧體積分?jǐn)?shù)，最低為9%，最高為21%。低氧艙的低氧程度相當(dāng)于臨床上OSAHS患者中、重度水平。實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)8周。

1.2.2 牙周臨床指數(shù)檢查 8周后，所有大鼠禁食12 h以上，麻醉后先拆除其結(jié)扎絲，用牙周探針測(cè)量各組大鼠雙側(cè)上頜第二磨牙的出血指數(shù)（bleeding index，BI）及牙周附著喪失（attachment loss，AL）并作記錄。BI的測(cè)定采用Mazza（1981）計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，AL為釉牙骨質(zhì)界至牙周袋底的距離。先用牙周探針測(cè)量牙周袋深度，當(dāng)探針退出時(shí)測(cè)得釉牙骨質(zhì)界到齦緣的距離，兩者相減為AL。每顆牙測(cè)量頰側(cè)近中、頰側(cè)中央、頰側(cè)遠(yuǎn)中3個(gè)位點(diǎn)，兩側(cè)牙共測(cè)量6個(gè)位點(diǎn)，取均值。上述所有操作均由同一醫(yī)師進(jìn)行。

1.2.3 影像學(xué)檢查和組織切片制作 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用斷頭法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，解剖取出上頜骨磨牙段。將上頜骨在多聚甲醛溶液中固定48 h，運(yùn)用牙科X線機(jī)對(duì)取出的上頜骨進(jìn)行影像學(xué)檢查，觀察牙槽骨吸收情況；然后用脫鈣液脫鈣2周，經(jīng)脫水、包埋后制作切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.2.4 牙齦組織及血清中IL-18、HIF-1α的檢測(cè) 大鼠空腹下，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r·min-14 ℃下離心15 min，取上清液，裝入EP管中，標(biāo)號(hào)，-70 ℃保存。牙齦組織樣本取自第二磨牙周圍牙齦組織，用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，制備組織勻漿（牙齦組織與鹽水體積比為1∶9）3 000 r·min-14 ℃下離心15 min，取上清液，標(biāo)號(hào)，-70 ℃保存。血清復(fù)溫至室溫，牙齦組織上清液用生理鹽水稀釋為1%的勻漿樣本（體積比1∶9），分別使用IL-18、HIF-1α ELISA試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，IL-18、HIF-1α的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，得到曲線方程：IL-18為Y=27.066x2+331.50x-10.997（R2=0.999 5），HIF-1α為Y=16.596x2+96.513x-2.257 7（R2=0.999 7）；通過曲線獲得各樣本的質(zhì)量濃度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組BI總體比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)，定量資料AL及ELISA結(jié)果組間比較采用方差分析，D組血清及牙齦組織中IL-18、HIF-1α質(zhì)量濃度與AL的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 牙周臨床指數(shù)檢查

各組大鼠的BI檢測(cè)結(jié)果見表1：A組與B組之間，C組與D組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而B組與D組之間，A組與C組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。D組AL與其余3組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B、C組AL值與A組之間的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 4組大鼠的BI和AL測(cè)量結(jié)果Tab 1 The results of BI and AL in four groups of rats n=8

2.2 影像學(xué)觀察

4組大鼠的X線檢查結(jié)果見圖1：A組牙槽骨無明顯吸收（圖1A）；B組有一定程度的牙槽骨吸收，牙周膜間隙明顯增寬（圖1B箭頭示）；C組牙槽骨有一定的骨質(zhì)吸收（圖1C箭頭示）；D組結(jié)扎區(qū)牙槽骨有較明顯的骨質(zhì)吸收，部分根分叉暴露（圖1D箭頭示）。

2.3 組織學(xué)觀察

4組大鼠牙周組織HE染色結(jié)果如圖2所示：A、C組根分叉區(qū)牙槽骨基本正常，B、D組根分叉區(qū)可見牙槽骨的骨吸收陷窩增加，牙周纖維紊亂、破壞，牙周組織破壞嚴(yán)重。

2.4 IL-18、HIF-1α質(zhì)量濃度的測(cè)定

4組大鼠IL-18、HIF-1α的質(zhì)量濃度見表2：B、C組的IL-18、HIF-1α質(zhì)量濃度明顯高于A組（P<0.05），D組高于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 4組大鼠牙槽骨的X線片F(xiàn)ig 1 X-ray images of alveolar bone in four groups of rats

圖2 4組大鼠上頜第二磨牙根分叉區(qū)組織學(xué)觀察 HE × 40Fig 2 Histological observation of the furcation of maxillary second molars in four groups of rats HE × 40

表2 4組大鼠血清及牙齦組織中IL-18、HIF-1α的表達(dá)Tab 2 Expression of IL-18 and HIF-1α in serum and gingival tissues in four groups of rats pg·mL-1, n=8,x±s

2.5 D組血清及牙齦組織中IL-18、HIF-1α質(zhì)量濃度與AL的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，D組血清中IL-18、HIF-1α質(zhì)量濃度與AL呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.792和0.753（P<0.05），D組牙齦組織中IL-18、HIF-1α質(zhì)量濃度與AL也呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.817和0.779（P<0.05）。

3 討論

牙周炎是一種涉及到免疫炎癥反應(yīng)的疾病，而OSAHS也是與炎癥相關(guān)的疾病。Ahmad等[8]發(fā)現(xiàn)：中重度牙周炎和OSAHS的發(fā)生有密切關(guān)系。間歇性低氧是OSAHS的一個(gè)顯著特征。Ryan等[9]認(rèn)為，OSAHS的間歇低氧/復(fù)氧可能是引起炎癥反應(yīng)的主要因素，引起炎癥的主要有兩條通路：1）依賴核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，從而形成炎癥反應(yīng)通路；2）依賴HIF-1產(chǎn)生的適應(yīng)性通路。Burioka等[10]也認(rèn)為：間歇性低氧能通過激活NF-κB信號(hào)通路，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子。基于此，本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定炎癥因子IL-18和HIF-1α來研究牙周炎和OSAHS發(fā)病相關(guān)的可能機(jī)制。

IL-18是重要的促炎細(xì)胞因子，與多種疾病關(guān)系密切。牙周炎患者的齦溝液及血清中IL-18水平均要明顯高于正常組[3,11]。有學(xué)者[12]對(duì)IL-18與牙周炎發(fā)生進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)二者存在相關(guān)性，可作為預(yù)測(cè)牙周炎發(fā)展過程的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。但是，目前仍然無充足的證據(jù)來解釋IL-18在牙周炎發(fā)生發(fā)展中所起的作用。Yoshinaka等[13]認(rèn)為，IL-18是通過CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand， RANKL）引起牙槽骨喪失，從而導(dǎo)致牙周炎發(fā)生。

HIF-1是一種氧調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物的生理疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[14]。HIF-1由α和β兩個(gè)亞單位構(gòu)成，與多種疾病密切相關(guān)[15-16]。在組織低氧的情況下，可以誘導(dǎo)HIF-1α蛋白水平增加。Ng等[17]認(rèn)為，由于炎癥牙周組織的血管微循環(huán)受阻，白細(xì)胞浸潤增加，牙周組織氧含量失調(diào)，產(chǎn)生的一些炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可以激活HIF-1通路，導(dǎo)致牙周組織中HIF-1α表達(dá)增加。有學(xué)者[18]通過氯化鈷模擬低氧實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低氧通過激活HIF-1α促進(jìn)牙周成纖維細(xì)胞的凋亡。這些實(shí)驗(yàn)均提示HIF-1α在牙周炎發(fā)展中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了慢性間歇低氧牙周炎大鼠模型，可以觀察到間歇低氧牙周炎組大鼠牙齦組織糜爛，影像學(xué)和組織學(xué)觀察顯示牙周組織破壞在4組中最為嚴(yán)重。BI結(jié)果顯示，低氧對(duì)照組與常氧對(duì)照組、低氧牙周炎組與常氧牙周炎組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能是樣本量較小的緣故。此外，低氧對(duì)照組與常氧對(duì)照組相比，低氧牙周炎組與常氧牙周炎組相比，AL的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明間歇低氧能促進(jìn)牙周附著喪失，加重牙周炎癥。同時(shí)，低氧對(duì)照組血清及牙齦組織中IL-18、HIF-1α質(zhì)量濃度較常氧對(duì)照組，低氧牙周炎組較常氧牙周炎組均有顯著升高（P<0.05），與蘇曉麗等[6]的部分研究結(jié)果一致。此外，低氧牙周炎組IL-18、HIF-1α的質(zhì)量濃度和AL存在正相關(guān)（P<0.05）。這些結(jié)果均說明慢性間歇低氧能促進(jìn)牙槽骨的附著喪失，加重牙周炎癥，并且與IL-18、HIF-1α的表達(dá)有關(guān)。慢性間歇低氧誘導(dǎo)IL-18、HIF-1α表達(dá)的增加，可能是OSAHS加重牙周炎的機(jī)制之一。目前，關(guān)于慢性間歇低氧誘導(dǎo)IL-18的機(jī)制仍不清楚。Li等[5]認(rèn)為可能的機(jī)制是：1）許多細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-6誘導(dǎo)IL-18的表達(dá)；2）重復(fù)的夜間血氧不足和氧化應(yīng)激反應(yīng)直接誘導(dǎo)IL-18表達(dá)。有研究[19]表明，慢性間歇低氧可能通過激活NF-κB炎癥通路，使TNF-α、IL-8等炎癥細(xì)胞因子的濃度升高。由此推斷，慢性間歇低氧可能通過激活NF-κB炎癥通路，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-18表達(dá)的增加，從而加重牙周炎癥。

本文探討了慢性間歇低氧條件下大鼠血清及牙齦中IL-18、HIF-1α質(zhì)量濃度的變化，為研究OSAHS患者牙周炎的發(fā)病機(jī)制提供了相關(guān)依據(jù)，但OSAHS和牙周炎都是多因素作用的炎癥性疾病，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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