江漪，謝雯芳，代婉娟，劉妮，趙昉，張奉學(xué)

廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405

◆實(shí)驗(yàn)研究論著◆

七味白術(shù)散對輪狀病毒感染乳鼠sIgA、血清IFN-γ及小腸黏膜病理的影響

江漪，謝雯芳，代婉娟，劉妮，趙昉，張奉學(xué)

廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405

目的：通過輪狀病毒SA11株感染乳鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究七味白術(shù)散對腸道sIgA、血清IFN-γ及小腸黏膜病理改變的影響，探討其對小腸黏膜的保護(hù)作用。方法：給予灌胃病毒液的模型乳鼠連續(xù)灌胃七味白術(shù)散、病毒唑及生理鹽水。采集血清及小腸標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測乳鼠腸道sIgA、血清IFN-γ的含量，對乳鼠空腸段做石蠟切片HE染色觀察病理改變。結(jié)果：七味白術(shù)散組和病毒唑組乳鼠腹瀉天數(shù)較少，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。七味白術(shù)散組和病毒唑組病毒清除率均為100%，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。七味白術(shù)散組和病毒唑組小腸黏液sIgA較高，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。七味白術(shù)散組和病毒唑組IFN-γ升高，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常組小腸黏膜未見病理改變。模型組黏膜下層可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，黏膜上皮細(xì)胞有少量壞死脫落，肌層可見明顯的腫脹。病毒唑組可見黏膜下層結(jié)構(gòu)疏松，稍許水腫，黏膜層上皮細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變；肌層間些許腫脹，可見空染的區(qū)域和炎性細(xì)胞浸潤。七味白術(shù)散組小腸黏膜結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理改變。結(jié)論：七味白術(shù)散能加快對病毒的清除，改善腹瀉癥狀，減輕對小腸黏膜的損害。

輪狀病毒；腹瀉；七味白術(shù)散；sIgA；IFN-γ

中醫(yī)藥治療小兒泄瀉有悠久的歷史，病因病機(jī)和治法均已完善。宋代錢乙的《小兒藥證直訣》所載七味白術(shù)散是治療小兒泄瀉的傳統(tǒng)名方，臨床研究也表明其對嬰幼兒腹瀉有很好的療效。筆者針對七味白術(shù)散進(jìn)行輪狀病毒感染乳鼠小腸黏膜保護(hù)作用的研究，結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1動物分組及處理Balb/c乳鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，SPF級，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號SCXK（粵）2013-0002。雌雄各半，體重2～6 g。與母鼠一同購回，實(shí)驗(yàn)中正常哺乳。母鼠糞便檢測RV抗原陰性。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（23± 2）℃，相對濕度為（75±10）%。Balb/c乳鼠按窩分為正常組、模型組、病毒唑組、七味白術(shù)散組，每組6只。將除正常組外的Balb/c乳鼠第5天經(jīng)口灌胃病毒液50 μL，正常組同時(shí)給予生理鹽水50 μL。1 h后七味白術(shù)散組經(jīng)口灌胃1 g/mL中藥100 μL，病毒唑組給予病毒唑100 μL，正常組和模型組生理鹽水100 μL。給藥5天，每天1次。

1.2病毒輪狀病毒SA11株，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)免疫研究所贈送。經(jīng)MA104細(xì)胞上多次傳代提高毒力后，測定病毒滴度為4.5×107FFU/mL，-70℃凍存。

1.3藥物與試劑七味白術(shù)散的制備：七味白術(shù)散由人參、白術(shù)、茯苓、葛根、藿香、木香、甘草組成。按原處方比例稱取藥材（購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診部中藥房），用自來水→單蒸水→雙蒸水分別洗3次，放入錐形瓶中，加4倍體積的三蒸水浸泡2 h（人參另泡另煎），煎2次，第1次煎30 min，第2次煎15 min。去渣，將兩次所煎藥液混合，真空泵下濾器抽濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮成1 g/mL的藥液，密封，隔水煮沸消毒備用。病毒唑針劑（100 mg/mL，辰欣藥業(yè)股份有限公司），用生理鹽水稀釋成1.5 mg/mL。

1.4腹瀉的動態(tài)觀察乳鼠從第5天經(jīng)口灌胃病毒液后每天觀察腹瀉情況，并記錄每只乳鼠體重。第6天和第9天，收集各組每只乳鼠大便分別置于1.5 mL無菌EP管，加200 μL PBS緩沖液，震蕩2 min充分混勻，4℃ 1500 rpm、半徑10 cm、離心15 min，吸取上清做RV抗原ELISA檢測。

1.5血清SIgA、IFN-γ測定第9天給藥6 h后將乳鼠斷頭取血，2500 rpm、半徑10 cm、離心10 min，分離血清，用ELISA試劑盒檢測。

1.6小腸黏液sIgA測定解剖乳鼠，打開腹腔，分離小腸，取下從幽門下10 cm至回盲部前的這部分小腸，生理鹽水清洗2次，用眼科剪縱向剪開，濾紙吸干，用玻片刮下小腸黏液，置于1.5 mL無菌EP管，按照試劑盒操作說明，采用ELISA法檢測sIgA水平。

1.7小腸黏膜病理改變?nèi)∮拈T至幽門下10cm部分的空腸段，10%甲醛固定后制成石蠟切片，每只乳鼠2張，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察。

2　結(jié)果

2.1各組乳鼠腹瀉天數(shù)比較見表1。七味白術(shù)散組和病毒唑組乳鼠腹瀉天數(shù)較少，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　各組乳鼠腹瀉天數(shù)比較（±s）　　天

表1　各組乳鼠腹瀉天數(shù)比較（±s）　　天

與模型組比較，①P＜0.05

組別七味白術(shù)散組病毒唑組模型組正常組樣本數(shù)6 6 6 6腹瀉天數(shù)1.67±0.44①2.17±0.28①2.83±0.83 0

2.2各組糞便RV病毒清除率比較見表2。七味白術(shù)散組和病毒唑組病毒清除率均為100%，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　各組糞便RV病毒清除率比較　　例

2.3各組血清和小腸黏液sIgA結(jié)果比較見表3。七味白術(shù)散組和病毒唑組小腸黏液sIgA較高，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3　各組血清和小腸黏液sIgA結(jié)果比較（±s）　mg/mL

表3　各組血清和小腸黏液sIgA結(jié)果比較（±s）　mg/mL

與模型組比較，①P＜0.05

組別七味白術(shù)散組病毒唑組模型組正常組樣本數(shù)6 6 6 6血清sIgA 16.50±1.50 13.17±2.17 10.67±1.67 10.83±1.56小腸黏液sIgA 53.00±3.33①48.17±2.50①41.33±2.89 20.00±2.33

2.4各組血清IFN-γ測定結(jié)果比較見表4。七味白術(shù)散組和病毒唑組IFN-γ升高，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4　各組血清IFN-γ測定結(jié)果比較（±s）　pg/mL

表4　各組血清IFN-γ測定結(jié)果比較（±s）　pg/mL

與模型組比較，①P＜0.05

組別七味白術(shù)散組病毒唑組模型組正常組樣本數(shù)6 6 6 6 IFN-γ 56.67±3.78①52.50±3.17①48.33±4.00 58.83±4.44

2.5各組小腸黏膜病理改變比較見圖1、圖2、圖3、圖4。正常組小腸黏膜未見病理改變。模型組黏膜下層可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，黏膜上皮細(xì)胞有少量壞死脫落，肌層可見明顯的腫脹。病毒唑組可見黏膜下層結(jié)構(gòu)疏松，稍許水腫，黏膜層上皮細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變；肌層間些許腫脹，可見空染的區(qū)域和炎性細(xì)胞浸潤。七味白術(shù)散組小腸黏膜結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理改變。

圖1　正常組小腸黏膜病理改變（×100）

圖2　模型組小腸黏膜病理改變（×100）

圖3　病毒唑組小腸黏膜病理改變（×100）

圖4　七味白術(shù)散組小腸黏膜病理改變（×100）

3　討論

錢乙《小兒藥證直訣》：“人參切去頭二錢五分，白茯苓五錢，白術(shù)（炒）五錢，藿香葉五錢，木香二錢，甘草一錢，葛根五錢（渴者加至一兩）。上口父咀，每服三錢，水煎，熱盛發(fā)渴，去本香。”原方“治脾胃久虛，嘔吐泄瀉，頻作不止，津液枯竭，煩躁渴，但欲飲水，乳食不進(jìn)，羸弱困劣，因而失治，變成驚癰，不論陰陽虛實(shí)，并宜服”。自創(chuàng)制以來，一直被推崇為治療小兒泄瀉的經(jīng)典方劑。該方組方嚴(yán)謹(jǐn)，配伍精當(dāng)，為四君子湯加木香、藿香和葛根所成。四君子湯為益氣健脾的基礎(chǔ)方，有調(diào)理中焦，補(bǔ)中益氣的功效。木香、藿香芳香化濕、行氣止痛，加上葛根，升陽生津。全方藥性平和，溫而不燥，補(bǔ)中有瀉，寓瀉于補(bǔ)，使補(bǔ)益的同時(shí)不致氣機(jī)壅塞，瀉實(shí)時(shí)不致?lián)p傷正氣。同時(shí)也升提陽氣，生津止渴，兼顧泄瀉耗傷陰液的特點(diǎn)。

腸道是人體重要的器官，它吸收營養(yǎng)物質(zhì)維持人體正常的生命活動，另外，它有完整的腸道屏障能保證機(jī)體不受病原體的入侵和定植，是人體的第一屏障，它包括生物屏障、機(jī)械屏障、免疫屏障和化學(xué)屏障。sIgA是重要的生物屏障，它由漿細(xì)胞分泌，能有效的清除病毒，將其聚集便于隨著纖毛運(yùn)動排出，抑制病原體在腸道的黏附和定植；也可以加強(qiáng)沒有炎性反應(yīng)的免疫進(jìn)程，與T細(xì)胞結(jié)合，起到局部免疫調(diào)節(jié)作用，維持腸道免疫屏障的完整。sIgA的生成量直接影響腹瀉次數(shù)和腹瀉持續(xù)時(shí)間。因此，近來有研究表明，口服抗輪狀病毒雞卵黃免疫球蛋白能提高sIgA水平，緩解患兒腹瀉癥狀，減少腹瀉頻次，顯著縮短輪狀病毒腸炎病程［1～2］。本研究結(jié)果顯示，七味白術(shù)散能促進(jìn)小腸黏膜sIgA的分泌，增加細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生，加快病毒的清除。IFN-γ是TH1分泌的促炎性因子，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等重要生理功能。IFN-γ能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬病原體的能力，促進(jìn)T細(xì)胞增殖。IFN-γ的升高能在輪狀病毒感染早期起重要的免疫保護(hù)作用。輪狀病毒感染后，IFN-γ水平降低，本實(shí)驗(yàn)在給予七味白術(shù)散或病毒唑后，IFN-γ水平均升高，提高了機(jī)體抗病毒能力。也有研究表示，腸道外感染的BALB/C乳鼠皮下注射不同劑量的IFN-γ，中等劑量能對機(jī)體起良好的抗感染作用，大劑量則會造成肝臟損害［3］。

小腸黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成了一道機(jī)械屏障。輪狀病毒感染后，乳鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞空泡樣改變，出現(xiàn)壞死脫落，黏膜下層有炎性細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致小腸營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙，同時(shí)水電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收障礙，出現(xiàn)腹瀉。七味白術(shù)散及病毒唑治療后，上皮細(xì)胞未見明顯病理改變，且七味白術(shù)散小腸組織病變較病毒唑組輕，證明其能促進(jìn)小腸機(jī)械屏障功能的恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)研究提示，七味白術(shù)散能促進(jìn)小腸黏膜sIgA的分泌，增加IFN-γ的產(chǎn)生，加快病毒的清除，減輕對小腸黏膜的損傷，維護(hù)黏膜屏障的完整性；從而有效地控制腹瀉，防止脫水，恢復(fù)腸道吸收功能。

［1］張桂華.益生菌與口服免疫球蛋白輔助治療兒童輪狀病毒腸炎的療效比較［J］.中國醫(yī)藥指南，2015，13（7）：77.

［2］謝詠梅，王麗媛，高珊，等.口服免疫球蛋白對輪狀病毒腸炎患兒腸道sIgA分泌的影響［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（1）：71-74.

［3］楊梅.IFN-γ干預(yù)輪狀病毒腸道外感染的乳鼠與NF-κB表達(dá)相關(guān)性的研究［D］.蚌埠：蚌埠醫(yī)學(xué)院，2011.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

Effect of Qiwei Baizhu San on sIgA，Serum IFN-γ and Small Intestinal Mucosal Pathology of Rotavirus Infectionon Suckling Mice

JIANG Yi，XIE Wenfang，DAI Wanjuan，LIU Ni，ZHAO Fang，ZHANG Fengxue

Objective：To study the effect of Qiwei Baizhu san on sIgA，serum interferon gamma（IFN-γ）and small intestinal mucosal pathology of suckling mice infected by SA11 rotavirus，and to explore the protective effect for the small intestinal mucosa.Methods：Suckling mice infected by Virus solution orally，were intragastric administered Qiwei Baizhu san，ribavirin and saline respectively.Serum and intestinalsamples were collected to detect intestinalsIgA，and serum IFN-γ by ELISA，jejunum pathological changes by HE staining.Results：The diarrhea days of Qiwei Baizhu san group and ribavirin group were fewer than those in the model group（P＜0.05）.The virus clearance rate was 100%in Qiwei Baizhu san group and ribavirin group，and was higher than that in the model group（P＜0.05）.The intestinal mucous sIgA and serum IFN-γ in the Qiwei Baizhu san group and ribavirin group were higher than those in the model group，the differences being significant（P＜0.05）.There was no pathological changes in the intestinalmucosa in normalgroup.There was obvious inflammatory infiltration，and small necrosis and loss of the mucous epithelium，muscle swelling in the model group.Ribavirin group showed loose structure and slight edema in submucosal，mucosa epithelial cells without obvious pathological changes.There were some swelling between the muscles，visible air stained area and inflammatory cell infiltration in the ribavirin group.Qiwei Baizhu san group showed normal intestinal mucosa， no obvious pathological changes.Conclusion：Qiwei Baizhu san can accelerate the removal of virus，improve thesymptoms of diarrhea，reduce the damage of the smallintestinalmucosa.

Rotavirus；Diarrhea；Qiwei Baizhu san

R512.5

A

0256-7415（2015）09-0203-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.09.095

2015-01-20

江漪（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：藥物抗病毒。

張奉學(xué)，Email：doczhang@tom.com。