劉伶俐， 洪 波*， 楊羅輝， 王冬武， 高 峰， 羅 玲， 劉 麗， 李曉玲

(1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長沙 410153;2.長沙環(huán)境保護職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410004)

乙萘酚(2-Naphthol)是萘的2位氫被羥基取代后形成的化合物，是1-萘酚的異構(gòu)體，主要用于制作防老劑乙萘酚、有機顏料及殺菌劑，同時作為防腐劑被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，其污染載體涉及大氣、水體以及食品。乙萘酚作為食品添加劑在使用量和使用途徑上沒有嚴格的控制和規(guī)范的管理。雖然水產(chǎn)品中暫未出現(xiàn)相關(guān)報道，但出于對水產(chǎn)品質(zhì)量安全以及人體健康的考慮，建立乙萘酚在冷凍水產(chǎn)凍中的殘留檢測方法意義重大。

目前乙萘酚的測定方法主要有高效液相色譜[1，2]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]、氣相色譜-質(zhì)譜法[4]、直接熒光光度法[5]，此外還有毛細管區(qū)帶電泳法[6]，而用于水產(chǎn)品中乙萘酚的檢測方法未見報道。本文借鑒水果、蔬菜、水體的測定方法，擬建立一種準(zhǔn)確、簡便的檢測方法來測定水產(chǎn)品中乙萘酚殘留物。乙萘酚在食品當(dāng)中殘留時間長、降解速率慢。本實驗期望通過測定不同添加濃度和儲存時間的乙萘酚樣品的殘留量，揭示冷凍水產(chǎn)品中乙萘酚的自然降解規(guī)律。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀(美國，Waters公司)，配熒光檢測器(FD)；Q-101平行蒸發(fā)器(瑞士，Buchi公司)；Z323K高速冷凍離心機(德國，Hemel公司)；KQ5200DE超聲波清洗器(昆山超聲波儀器廠)；C18柱(500 mg/3mL，美國Varian科技有限公司)；LC-NH2固相萃取柱(500 mg/3mL，美國Varian科技有限公司)。

乙萘酚標(biāo)準(zhǔn)品(99%，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)。取乙萘酚標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的貯備液，再分別移取適量的貯備液配制成質(zhì)量濃度分別為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯(色譜純，美國Tedia 公司)；甲苯(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；酸化乙腈：在1 L乙腈中加入8 mL 50%HCl；乙腈-甲苯溶液：乙腈和甲苯按體積比3∶1混合。實驗用水為超純水(≥18.2 MΩ·cm)。

1.2 樣品制備

取出冷凍水產(chǎn)品供試樣品，在常溫下自然解凍，取適量的樣品制成細小、均勻的魚糜樣。

1.3 樣品提取與凈化

稱取5.00 g(±0.02 g)的樣品置于50 mL離心管中，加入15 mL酸化乙腈，勻漿30 s，35 ℃超聲提取10 min，5 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至平行蒸發(fā)管中，重復(fù)提取1 次，上清液合并至蒸發(fā)管中，經(jīng)40 ℃平行蒸發(fā)至近干，加入3 mL乙腈-甲苯溶液溶解殘留物。

將蒸發(fā)管置于-60 ℃超低溫冰箱中，冷凍處理15 min，取出后立即將液體全部轉(zhuǎn)移至使用5 mL 乙腈、5 mL 乙腈-甲苯溶液活化的LC-NH2固相萃取柱，用4.00 mL乙腈-甲苯溶液洗脫，40 ℃氮氣吹至干，用1.00 mL流動相溶解后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Inertil ODS-SP C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶水=50∶50(V/V)；柱溫：35 ℃；流速：0.80 mL/min；進樣量：30 μL；檢測波長：λex=250 nm，λem=410 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

根據(jù)文獻報道，掃描乙萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光光譜，結(jié)合樣品基質(zhì)的響應(yīng)強度，確定方法的激發(fā)波長為激發(fā)波長λex=250 nm，發(fā)射波長λem=410 nm。

2.2 提取溶液與提取方式的選擇

目前乙萘酚樣品的處理方式主要是有機試劑浸提[7]、溴酸鉀-羅丹明6G催化[8]等方式。實驗以乙腈-水、乙腈及酸化乙腈做提取劑進行對比試驗。在相同條件下，以乙腈-水配制成體積比分別為70∶30、50∶50、30∶70的提取液分次提取后，加入乙酸乙酯進行反萃取，離心后上下層之間有乳白色絮狀物形成，影響提取效果，且乙酸乙酯的反萃取效率較低，回收率僅為20.3%；乙腈分次提取的效果明顯好于乙腈-水，回收率在65.5%左右，但在提取如南美白對蝦、鰻鱺等脂肪、蛋白質(zhì)含量高的樣品時易在提取液下層形成一定體積的油狀物，從而對樣品濃縮和定容造成影響；采用酸化乙腈較好地解決了蛋白質(zhì)乳化影響，分次提取后濃縮的樣品色譜圖干擾峰極少，回收率較高，均在70.3%以上。實驗選用酸化乙腈作為乙萘酚樣品的提取溶劑。

2.3 凈化方式的選擇

乙萘酚樣品的凈化以固相萃取、液液萃取、分散液相微萃取等方式為主。實驗分別對C18柱凈化、冷凍去脂與LC-NH2固相萃取組合凈化兩種方式進行了比較。前一種方式在樣品濃縮后分別加入3 mL甲醇和3 mL乙腈-甲苯溶液分次溶解殘留物，經(jīng)C18柱凈化；后者直接采用乙腈-甲苯溶液溶解，冷凍去脂與LC-NH2固相萃取組合凈化處理。結(jié)果顯示：前者的分析圖譜無干擾影響，但回收率始終低于65.1%；而后一種方式處理的各類樣品的回收率均在70%以上，且樣品在此色譜條件下分離效果更好，滿足分析要求。因此確立酸化乙腈提取、冷凍去脂與LC-NH2固相萃取組合凈化的方式。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與方法檢出限

按1.4節(jié)的儀器條件對系列標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進樣分析，以峰面積對濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以3 倍信噪比(S/N)計算檢出限。結(jié)果表明：乙萘酚的方法檢出限為0.10 mg/kg，在0.50～10.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

2.5 回收率與精密度

以草魚、鰻鱺、南美白對蝦的陰性樣品添加0.50、1.00、5.00 mg/kg 3 個濃度的乙萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度做3個平行，按1.3節(jié)進行處理。計算出乙萘酚加標(biāo)樣品的平均回收率為74.8%～91.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～9.4%，均滿足實驗室藥物殘留檢測的要求，相關(guān)數(shù)據(jù)如表1所示。

2.6 實際樣品的測定

在通過對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和添加樣品反復(fù)試驗驗證方法的準(zhǔn)確性和可靠性的基礎(chǔ)上，采用本方法對3 個批發(fā)市場隨機抽取的20 個冷凍樣品進行分析測定，結(jié)果均為陰性。

表1 冷凍水產(chǎn)品中乙萘酚的添加回收率及精密度

圖1 乙萘酚的降解率曲線圖Fig.1 Degradation rate of 2-naphthal

2.7 乙萘酚降解試驗

在空白樣品中添加1.00、10.0、50.0 mg/kg 3個濃度水平乙萘酚，每個濃度做5個平行，進行冷凍水產(chǎn)品中乙萘酚的降解試驗。對樣品進行24、48、72、168 h和240 h取樣測定，整個試驗過程樣品保持在閉光冷凍狀態(tài)。實驗表明1.00、10.0、50.0 mg/kg 3個濃度的降解速率按添加水平由高到低成比例關(guān)系，分別為50.0 mg/kg >10.0 mg/kg>1.00 mg/kg，降解率如圖1所示，3個濃度在24 h均有明顯下降，在48 h趨近平緩，之后物質(zhì)的降解不明顯，殘留水平穩(wěn)定。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜-熒光檢測法測定冷凍水產(chǎn)品中的乙萘酚殘留，以酸化乙腈提取可有效地去除樣品中蛋白質(zhì)的影響，同時具有較高的提取效率；冷凍去脂和LC-NH2固相萃取組合凈化處理的方式避免了液夜萃取存在的耗時長、成本高、有機試劑用量大等問題。方法簡便、有效，能有效去除復(fù)溶液中脂肪類物質(zhì)的干擾；采用Inertil ODS-SP C18柱作為固定相，以乙腈-水(50∶50，V/V)作為流動相，為本方法提供了高分離度。該方法簡便、穩(wěn)定、處理成本低、回收率高，能滿足水產(chǎn)品中乙萘酚的殘留檢測。乙萘酚殘留物穩(wěn)定性試驗采用空白樣品添加，避光冷凍儲存24、48、72、168和240 h后取樣測定。發(fā)現(xiàn)在5 個時間段的測定結(jié)果，除在24 h時有一個明顯下降之后，殘留物的濃度變化不大，降解率不明顯，表明乙萘酚殘留物在冷凍避光的情況下穩(wěn)定性好，具有持續(xù)的污染能力。