李　惠，沈　澎，盧大雷，徐　丹，王衛(wèi)杰

（開封醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所醫(yī)用細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室，河南 開封　475000）

觀察飼料添加劑對幼犬性激素水平的影響

李惠，沈澎，盧大雷，徐丹，王衛(wèi)杰

（開封醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所醫(yī)用細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室，河南 開封475000）

研究分析市場上正在廣泛使用的飼料添加劑，探討二次飼喂雄性幼犬后飼料添加劑蓄積對其生長、生殖發(fā)育的影響研究。選擇12只1月齡犬，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，對照組飼喂正常犬日糧和正常對照組老鼠，試驗(yàn)組飼喂高劑量組大鼠和正常犬日糧，喂養(yǎng)幼犬直至成熟，檢測食用飼料添加劑大鼠是否對雄性犬的生長、生殖發(fā)育產(chǎn)生影響。采用酶聯(lián)免疫試劑盒的方法來檢測犬血清激素指標(biāo)水平。試驗(yàn)組雌二醇、促卵泡激素含量明顯升高（P＜0.01），而睪酮含量明顯降低，有顯著性差異（P＜0.01），飼料添加劑高劑量組對犬血清中的促黃體生成未見顯著變化。

飼料添加劑；犬；性激素水平；蓄積

隨著飼料工業(yè)發(fā)展，飼料添加劑在我國得到了迅速的應(yīng)用和推廣，添加劑的種類在增加，其作用也不僅僅是促進(jìn)生長，一些添加劑已成為促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收或保證動(dòng)物營養(yǎng)生理功能正常發(fā)揮所必需的物質(zhì)，成為全價(jià)飼料中必不可少的組成部分。但是，有些飼料添加劑如果殘留在畜產(chǎn)品中和通過糞尿排出，將會(huì)造成環(huán)境土壤、表層水體、植物和動(dòng)物等的藥物蓄積或殘留，從而對人的健康和環(huán)境產(chǎn)生不良影響。

為了檢測食用飼料添加劑大鼠是否對雄性犬的生長、生殖發(fā)育產(chǎn)生影響，并初步探討其作用的相關(guān)機(jī)制，從而為進(jìn)一步研究動(dòng)物飼料添加劑對雄性犬的生長發(fā)育的影響及其環(huán)境危險(xiǎn)度評價(jià)提供初步試驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠：26日齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量為（85.05± 4.48）g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。自由飲水，實(shí)驗(yàn)室溫度為22～24℃，空氣相對濕度控制在50%～65%，室內(nèi)照明以自然采光為主，環(huán)境較安靜。

選用從農(nóng)村收購的13只犬，3只公犬10只母犬，體質(zhì)量為3.8～4.5 kg左右。為了排除遺傳因素的影響，將3只公犬和10只母犬交配所生的幼犬，從10窩中選取6窩，每窩選用2只體格健壯、發(fā)育良好、體質(zhì)量相近的犬作為對照組和試驗(yàn)組，共計(jì)12只。

1.2飼料添加劑

市售4%仔豬用復(fù)合預(yù)混料。

1.3主要試劑

犬雌二醇（E2）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，犬促黃體生成素（LH）酶聯(lián)試劑盒，犬促卵泡素（FSH）酶聯(lián)免疫試劑盒，犬睪酮（T）酶聯(lián)免疫分析試劑盒。

2　試驗(yàn)方法

2.1飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)組和對照組犬全部飼養(yǎng)于同一動(dòng)物舍，由專人采取相同的飼養(yǎng)管理方式。犬進(jìn)欄前3 d對欄舍和食槽進(jìn)行清洗、消毒，然后標(biāo)記號(hào)。試驗(yàn)前進(jìn)行驅(qū)蟲，并按常規(guī)免疫注射疫苗，預(yù)試7 d結(jié)束后，早晨空腹逐頭稱重，經(jīng)驗(yàn)收各組平均體質(zhì)量無差異，作為起始體質(zhì)量，進(jìn)入正式試驗(yàn)。該試驗(yàn)采用群飼，每天喂料2次，投料時(shí)間為早上8∶00，下午4∶00。飼料計(jì)量不限量，給食以吃飽而食槽無剩余料為原則，保證充足清潔飲水，每天打掃動(dòng)物舍2次（上午、下午各1次），每兩天沖洗1次，每星期消毒2次。記錄各組投料量與剩料量，并觀察犬的生長發(fā)育、拉稀、采食等健康情況。

2.2飼料制備及喂養(yǎng)

2.2.1試驗(yàn)劑量的確定

采用直接計(jì)算法：即將已知?jiǎng)游飸?yīng)用劑量換算成mg/m2，再求實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的適用劑量。

2.2.2飼料制備

用飼養(yǎng)老鼠用的普通飼料，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)將飼料劑量確定為：4%飼料添加劑配制成百分含量為0%、30%，正常劑量組采用0%的混合飼料；高劑量組采用30%的混合飼料。

2.2.3喂養(yǎng)劑量

配方：肉類524 g（57.3%），谷類300 g（32.7%），蔬菜76 g（8.3%），鹽15 g（1.7%）。犬的每日食量按0.262 kg計(jì)算。

幼犬每日肉類：0.262×57.3%=0.150 kg；實(shí)驗(yàn)大鼠平均重量300.00 g，大約需要0.5只；試驗(yàn)組及對照組幼犬2月齡開始喂養(yǎng)0.5只大鼠，以后每月增加0.5只；對照組飼喂正常犬日糧和正常對照組老鼠，試驗(yàn)組飼喂高劑量組大鼠和正常犬日糧，飼喂期為10個(gè)月。

大鼠去皮，用水洗凈，切碎煮熟，再混入蔬菜，短時(shí)間煮沸，使之成為混合的肉菜湯，加入谷類食物。蔬菜應(yīng)充分沖洗，除去泥沙。

2.3犬血清激素指標(biāo)測試方法

2.3.1放射免疫法測定激素水平的原理

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

2.3.2試劑盒的使用

試劑盒采用上海江萊生物科技有限公司試劑盒。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS19.0作方差分析、X2檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)分析，對于部分?jǐn)?shù)據(jù)作圖及相關(guān)分析。

4　結(jié)果

4.1犬體質(zhì)量測定結(jié)果

該試驗(yàn)中，試驗(yàn)各組犬的體質(zhì)量從4個(gè)月開始明顯增高（P＜0.01），分別給予不同天數(shù)喂養(yǎng)后，試驗(yàn)組犬體質(zhì)量與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（結(jié)果見表1）。

4.2犬的血清激素指標(biāo)結(jié)果

與對照組相比，試驗(yàn)組雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）含量明顯升高（P＜0.01），而睪酮（T）含量明顯降低，有顯著性差異（P＜0.01），飼料添加劑高劑量組對犬血清中的促黃體生成（LH）未見顯著變化（結(jié)果見表2）。

表1　試驗(yàn)各組犬體質(zhì)量變化結(jié)果/kg（x±s）

表2　試驗(yàn)中各組犬的血清激素指標(biāo)結(jié)果（x±s）

5　討論

5.1雄性幼犬食用實(shí)驗(yàn)大鼠對其體質(zhì)量的影響

動(dòng)物體質(zhì)量是化學(xué)毒物引起機(jī)體和器官組織的損傷和病理學(xué)改變的重要而敏感的指標(biāo)之一。由于體質(zhì)量的變化可以反映飼料添加劑對犬生長發(fā)育的影響，因此，以體質(zhì)量作為飼料添加劑對機(jī)體生長指標(biāo)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，雄性幼犬食用實(shí)驗(yàn)大鼠后，試驗(yàn)組與對照組犬的生長指標(biāo)體質(zhì)量從4月齡開始明顯增高，試驗(yàn)組雄性犬比對照組雄性犬生長速度快。說明隨著飼喂實(shí)驗(yàn)大鼠飼料添加劑含量的逐漸升高，犬的體質(zhì)量逐漸增加，飼料添加劑對犬體質(zhì)量有一定的影響，在一定程度上促進(jìn)了犬的生長。

5.2雄性幼犬食用實(shí)驗(yàn)大鼠對其血清激素指標(biāo)的影響

雄性性活動(dòng)受多種因素的影響，如神經(jīng)機(jī)制、體液因素、情緒、年齡、疾病等。其內(nèi)分泌調(diào)節(jié)主要受下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)控，其中垂體分泌促黃體生成素和促卵泡激素，而內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)精子的生發(fā)過程，對精子的生發(fā)過程起著重要的作用，睪丸的生精功能主要受這兩種激素的調(diào)節(jié)［1-2］。促卵泡激素對精子發(fā)生的調(diào)節(jié)作用主要是通過支持細(xì)胞對精子發(fā)生的啟動(dòng)和生殖細(xì)胞的分化上。促卵泡激素水平的高低受睪丸支持細(xì)胞分泌的抑制素調(diào)節(jié)［3］。

青春期前處于一個(gè)相對平衡的狀態(tài)。當(dāng)進(jìn)入青春期時(shí)，下丘腦對少量雄激素（主要是睪酮）的負(fù)反饋的敏感性驟降，導(dǎo)致下丘腦釋放促性腺激素釋放激素增多，刺激垂體分泌促黃體生成素和促卵泡激素，促黃體生成素刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮，促黃體生成素和促卵泡激素再反饋刺激性腺分泌性激素，使性器官及性征相繼發(fā)育，同時(shí)升高的雄激素（主要是睪酮）又對下丘腦和垂體激素的合成與分泌起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，由此使下丘腦-垂體-睪丸軸的活動(dòng)在較高的水平上建立新的聯(lián)系。在此過程中，促性腺激素及性激素在體內(nèi)的水平均有提高。一般認(rèn)為該系統(tǒng)的發(fā)動(dòng)引起了生殖系統(tǒng)的快速生長，出現(xiàn)第二性征的發(fā)育。

雄性動(dòng)物體內(nèi)亦含有雌二醇等雌激素，以雌二醇生物活性最高，它由周邊組織如皮膚將睪酮轉(zhuǎn)化而來，也來自體內(nèi)腎上腺和睪丸的少量分泌。睪丸內(nèi)產(chǎn)生的雌激素是以雄激素-睪酮為來源［4］，經(jīng)過酶的催化而轉(zhuǎn)化為雌二醇，雌二醇作用于下丘腦，調(diào)節(jié)下丘腦促性腺激素釋放激素的脈沖性釋放，從而調(diào)節(jié)了垂體促性腺激素的釋放。此外，雌二醇還能在睪丸內(nèi)對睪酮進(jìn)行調(diào)節(jié)，雌二醇含量異常增高可抑制睪酮的合成。

該研究中，各組犬血清雌二醇、促卵泡激素含量與對照組相比均明顯升高，睪酮含量與對照組相比明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。雌二醇含量的異常增高，破壞了體內(nèi)雌激素——雄激素平衡，從而引起機(jī)體血清睪酮水平降低。該試驗(yàn)中，隨著飼喂實(shí)驗(yàn)大鼠的飼料添加劑劑量增加，犬的睪丸重量減輕，因?yàn)椴G丸的大小主要是由支持細(xì)胞的數(shù)量決定，因此睪丸支持細(xì)胞的數(shù)量必定減少，從而抑制了抑制素的合成和分泌，血清抑制素水平的降低反饋性地使腦垂體持續(xù)分泌促卵泡激素，從而使血清促卵泡激素水平升高。血清睪酮水平降低同時(shí)刺激垂體分泌促黃體生成素和促卵泡激素，引起促卵泡激素水平升高。該試驗(yàn)結(jié)果說明飼料添加劑可使血清雌二醇水平升高，從而抑制睪酮合成、降低血清睪酮水平。研究結(jié)果提示食用實(shí)驗(yàn)大鼠可降低雄性幼犬精子質(zhì)量，從而影響青春期雄性幼犬生殖器官的發(fā)育，引起生殖系統(tǒng)的損傷。

飼料添加劑對性功能的作用仍需進(jìn)一步研究，其相關(guān)機(jī)制仍有待深入探討。作者認(rèn)為可能與以下因素有關(guān)：①超量飼喂大鼠，可能引起雄性幼犬肥胖，進(jìn)而影響其性功能；②二次飼喂蓄積可能也對其生殖情況產(chǎn)生影響，其相關(guān)機(jī)制仍有待深入探討。目前一些飼料添加劑使用不當(dāng)或過量不僅對動(dòng)物產(chǎn)生危害作用，而且通過糞尿排出，將會(huì)造成環(huán)境土壤、表層水體、植物和動(dòng)物等的藥物蓄積或殘留，從而對人的健康和環(huán)境產(chǎn)生不良影響。因此，對飼料添加劑進(jìn)行深入研究，掌握其對動(dòng)物的影響、作用機(jī)制以及環(huán)境中的殘留問題等情況，可為國家制定相應(yīng)的法律提供依據(jù)，對保證人類的身體健康、提高生活質(zhì)量具有重要的意義。

［1］李紅，等.不同濃度的谷氨酰胺對幼狗生長性能的影響［J］.中國飼料添加劑，2006，（7）：33-35.

［2］張磊.微量元素對種公牛精液品質(zhì)的影響［D］.揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

［3］于文會(huì)，等.中藥飼料添加劑對狗生長性能和生理生化指標(biāo)的影響［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2008，27（4）：7-10.

［4］郭慧君，等.日糧中添加大豆黃酮對大鼠生長性能和有關(guān)內(nèi)分泌的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（4）：59-61.

S816

B

1004-5090（2015）03-0008-03

2015-01-01）