于 微，馬春麗，孫婷婷，劉 美，鄒 莉，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.遼寧輝山乳業(yè)集團(tuán)有限公司，遼寧 沈陽 110164）

產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選及對農(nóng)家干酪保質(zhì)期的影響

于 微1，馬春麗2，孫婷婷1，劉 美3，鄒 莉1，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.遼寧輝山乳業(yè)集團(tuán)有限公司，遼寧 沈陽 110164）

從實驗室保存的7 株乳酸菌中，經(jīng)分離純化，以金黃色葡萄球菌為指示菌，篩選獲得1 株高產(chǎn)細(xì)菌素的菌株KLDS 1.0338，排除有機酸和過氧化氫的干擾以及蛋白酶敏感性實驗，確定抑菌作用是由細(xì)菌素產(chǎn)生的。通過菌株形態(tài)學(xué)分析，生理生化及16S rDNA分析鑒定菌株KLDS 1.0338為干酪乳桿菌ATCC 334。進(jìn)一步利用該菌株制作農(nóng)家干酪，考察4 ℃貯藏期間干酪的變化，添加KLDS 1.0338干酪乳桿菌的實驗組抑菌活性顯著大于未添加KLDS 1.0338干酪乳桿菌組（P＜0.01），實驗組的pH值下降平緩，可以有效延長農(nóng)家干酪的貨架期，并保持產(chǎn)品原有的色澤、風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)等感官特性。

細(xì)菌素；分離篩選；農(nóng)家干酪；保質(zhì)期

細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)，可以殺滅或者抑制環(huán)境中的其他微生物［1-4］。乳酸菌所產(chǎn)的細(xì)菌素能夠抑制食品中某些腐敗菌和致病微生物生長繁殖［5-7］，具有防腐保鮮的重要作用，有望作為天然防腐劑代替化學(xué)防腐劑的潛在價值［8-10］。因此乳酸菌細(xì)菌素的研究和開發(fā)利用成為近年來的熱點，而備受關(guān)注［11-14］。目前廣泛應(yīng)用于食品保鮮的乳酸菌素主要有乳酸鏈球菌素（Nisin）和乳酸片球菌素（Pediocin）［15-16］，Roberts等［17］將Nisin產(chǎn)生菌株與奶酪發(fā)酵菌株用于奶酪的生產(chǎn)加工，可以延長奶酪的貨架期。但在一些特殊的微生態(tài)環(huán)境中分離出抑菌譜更寬的乳酸菌素，Topisirovic等［18］分離得到的乳桿菌所產(chǎn)的乳酸菌素既能抑制革蘭氏陽性菌生長，也能抑制革蘭氏陰性菌的生長繁殖，在食品貯藏方面顯現(xiàn)出了極大潛力。

本研究從7 株乳酸菌中篩選一株出產(chǎn)細(xì)菌素較高的菌株，并將該菌株應(yīng)用于農(nóng)家干酪生產(chǎn)，探討其對延長農(nóng)家干酪保質(zhì)期的作用，為該乳酸菌菌株的應(yīng)用及尋找新型乳酸菌細(xì)菌素提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株及發(fā)酵劑

受試菌：鼠李糖乳桿菌KLDS 1.0370、德式乳桿菌保加利亞亞種KLDS 1.0307、干酪乳桿菌KLDS 1.0338、嗜酸乳桿菌KLDS 1.0380、腸膜明串珠球菌KLDS 5.0401、發(fā)酵乳桿菌KLD S 1.0640、約氏乳桿菌KLDS 1.0703，均由乳品科學(xué)教育部重點實驗室工業(yè)微生物菌種保藏中心（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)）保藏。商業(yè)干酪發(fā)酵劑：乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis）、乳脂鏈球菌（Streptococcus cremoris），購自丹尼斯克（中國）公司。

指示菌：金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 25923，購自中國藥品生物制品鑒定所。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌、NB培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，PCA培養(yǎng)基檢測細(xì)菌總數(shù)，培養(yǎng)基成分按照文獻(xiàn)［19］配制。

1.1.3試劑

瓊脂糖 美國Sigma公司；DNA回收試劑盒、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP 北京天根生化科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、過氧化氫酶日本TaKaRa公司；氫氧化鈉、乙酸鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

DK-8K恒溫水浴鍋 英國Stable Micro Systems公司；9700PCR儀 美國Applied Biosystems公司；徠卡DMLB型顯微 鏡 德國徠卡顯微鏡公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海智城儀器公司；BCN1360型潔凈工作臺上海佳勝實驗設(shè)備有限公司；干酪槽 丹麥Foss公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國Upland公司；320 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3方法

1.3.1菌株活化與分離純化

菌株于-80 ℃冷凍保存，使用前接種于MRS液體培養(yǎng)基中活化，將菌液在固體培養(yǎng)基中三區(qū)劃線，活化傳代兩次，每次分別于37 ℃過夜培養(yǎng)，選取單菌落進(jìn)行鏡檢。指示菌在NB培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.3.2抑菌活性測定

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法［20］。首先將過夜培養(yǎng)的指示菌懸濁液均勻涂在NB平板上，在無菌狀態(tài)下，培養(yǎng)皿干燥30 min。將內(nèi)徑為6 mm的牛津杯均勻放置在平板上，下壓使其無間隙，將200 μL發(fā)酵上清液滴入牛津杯孔內(nèi)，并在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，取出培養(yǎng)皿，用游標(biāo)卡尺測抑菌圈直徑的大小，確定其抑菌效果［21］。每個樣品做3 次平行實驗，確保實驗的準(zhǔn)確性。

干擾因素的排除：發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min，4 ℃離心15 min后，用濃度為1.0 mol/L的氫氧化鈉調(diào)整發(fā)酵上清液的pH值為7.0，排除有機酸的干擾；將過氧化氫酶溶解在0.02 mol/L的乙酸鈉緩沖液（pH 7.0），使過氧化氫酶的終質(zhì)量濃度為5 g/L，37 ℃水浴2 h，排除過氧化氫的干擾。上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白酶敏感性實驗：將發(fā)酵上清液的pH值調(diào)至各酶最適pH值，分別加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K（酶的質(zhì)量濃度1.5 g/L），在37 ℃條件下處理1 h后，沸水浴處理3 min使酶失活，冷卻后調(diào)pH值為7，測定抑菌活性的變化情況［22］。

1.3.3目標(biāo)菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：在MRS培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)的目的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。同時觀察目標(biāo)菌在MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的菌落狀態(tài)。

生理生化鑒定：根據(jù)糖醇發(fā)酵實驗、特異性酶實驗，對菌株進(jìn)行生理生化鑒定［19］。

16S rDNA分析：將篩選出抑菌活性強的乳酸菌菌種，用細(xì)菌通用引物以及特異性引物直接進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR采用20 μL反應(yīng)體系：無菌水13.8 μL，10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，10 μmol/L引物F 0.5 μL，10 μmol/L引物R 0.5 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，在94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min并循環(huán)30 次；最后72 ℃終延伸10 min［23］。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂凝膠電泳后，用北京天根生化科技有限公司的DNA回收試劑盒回收目的片段并測序。

1.3.4農(nóng)家干酪的制作

對照組為商業(yè)發(fā)酵劑，實驗組為商業(yè)發(fā)酵劑+干酪乳桿菌KLDS 1.0338。

農(nóng)家干酪的加工工藝：脫脂乳→標(biāo)準(zhǔn)化→均質(zhì)→殺菌→冷卻（30～32 ℃） →發(fā)酵劑→氯化鈣→凝乳酶→凝乳→切割→靜止（20～40 min）→加溫攪拌→排乳清→清洗→瀝干→拌鹽（1%）→貯藏（4 ℃）［24］。

1.3.5農(nóng)家干酪貯藏過程中相關(guān)指標(biāo)的測定

成品的農(nóng)家干酪于4 ℃條件下貯藏18 d，每3 d測定1 次干酪的細(xì)菌總數(shù)、pH值以及抑菌活性，每6 d對干酪進(jìn)行1 次感官評定。

細(xì)菌總數(shù)測定：采用平板菌落計數(shù)法測定［19］。將25 g奶酪樣品加到225 mL的生理鹽水中，用電子攪拌器均質(zhì)。在生理鹽水中依次進(jìn)行倍比稀釋，選擇3 個適當(dāng)?shù)南♂屘荻?，使用PCA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)。

感官評定：在食品工藝室內(nèi)進(jìn)行，選擇10 名從事本專業(yè)的研究人員組成評定小組，評定方法根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)NY478—2002《軟質(zhì)干酪》中非成熟軟質(zhì)干酪感官要求，稍有改動，具體如表1所示。

表1　感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table1 Sensory evaluation criteriaa

2　結(jié)果與分析

2.1高產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

表2　不同乳酸菌抑菌活性Table2 Antimicrobial activities of bacteriocins from seven strains of lactic acid bacteria

選取Staphylococcus aureus為指示菌，用活化后的7 株乳酸菌發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌實驗，如表2所示，篩選出具有較強抑菌效果的菌株KLDS 1.0338。由表3可知，菌株KLDS 1.0338發(fā)酵上清液中排除有機酸、過氧化氫的干擾，仍保持抑菌活性，表明發(fā)酵上清液中有機酸、過氧化氫不是主要的抑菌物質(zhì)，對發(fā)酵上清液進(jìn)行胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K的酶解實驗，表明抑菌物質(zhì)對胰蛋白酶、胃蛋白酶敏感性較高，對蛋白酶K不敏感，確定發(fā)酵上清液中抑菌活性物質(zhì)是蛋白類物質(zhì)，是一類細(xì)菌素。

Table3 Antimicrobial activity of bacteriocin from strain KLDS 1.0338after different treatments

2.2菌株KLDS 1.0338的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

圖1　菌株KLDS 1.0338菌落形態(tài)（a） 和菌體形態(tài)（b，放大100 倍）圖Fig.1 Colony morphology （a） and cell morphology （b， 100× amplification） of strain KLDS 1.0338

由圖1可知，菌株KLDS 1.0338在MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h后，菌落中等大小，呈乳白色，周邊無褶皺，有光澤，菌落周圍有明顯透明圈。菌株KLDS 1.0338在MRS液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，菌體革蘭氏染色呈陽性，無芽孢，菌體呈短桿狀，菌體間成鏈狀。

2.2.2生理生化鑒定

目標(biāo)菌株KLDS 1.0338的生理生化特征如表4所示。根據(jù)參考文獻(xiàn)［25］初步鑒定該菌株為干酪乳桿菌。

表4　生理生化實驗結(jié)果Table4 Results of physiological and biochemical experiments

2.2.316S rDNA分析

圖2　KLDS 1.0338 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification of KLDS 1.0338

由圖2可知，菌株KLDS 1.0338在1 500 bp處獲得目的條帶，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收并測序。將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，菌株KLDS 1.0338與Lactobacillus casei ATCC 334的同源性為99%，從而初步確定為干酪乳桿菌。

2.2.4特異性PCR結(jié)果分析

用干酪乳桿菌的特異性引物PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示，菌株KLDS 1.0338在416 bp處獲得了預(yù)期的特異性唯一條帶，無雜帶，進(jìn)一步驗證了鑒定結(jié)果的正確性。

圖3　KLDS 1.0338特異性PCR結(jié)果Fig.3 Result of specific PCR of KLDS 1.0338

2.3干酪4 ℃貯藏期間的變化

2.3.1干酪4 ℃貯藏期間細(xì)菌總數(shù)的變化

圖4　干酪在4 ℃貯藏時細(xì)菌總數(shù)的變化Fig.4 Changes in total bacterial count of cheese stored at 4 ℃

由圖4可知，貯藏期間細(xì)菌總數(shù)呈上升趨勢，前3 d添加干酪乳桿菌（實驗組）和未添加干酪乳桿菌（對照組）兩組干酪的細(xì)菌總數(shù)變化較小，曲線變化比較遲緩，表明兩組干酪的細(xì)菌總數(shù)變化差異不明顯。第3天以后，對照組的細(xì)菌總數(shù)明顯增加，曲線呈上升趨勢，并且細(xì)菌總數(shù)的增加速率較為明顯，而添加KLDS 1.0338干酪的細(xì)菌總數(shù)也有所增加，但是變化曲線相對較 小，說明實驗組的細(xì)菌總數(shù)增加速率較慢，對照組的細(xì)菌總數(shù)顯著高于實驗組（P＜0.05）。國家標(biāo)準(zhǔn)是干酪的細(xì)菌總數(shù)超過5.00×105CFU/g為不合格，對照組的干酪在第9天已經(jīng)超標(biāo)，而實驗組的干酪放到第15天時將超

干酪貯藏過程中，添加KLDS 1.0338實驗組和未添加KLDS 1.0338對照組的變化整體呈逐漸下降趨勢，說明細(xì)菌素的抑菌活性逐漸降低，見圖6。在貯藏前3 d，實驗組的抑菌活性與對照組相比是比較顯著（P＜0.05），隨著貯藏時間的延長，抑菌活性發(fā)生明顯變化，實驗組顯著高于對照組（P＜0.01），但12 d之后，對照組與實驗組的抑菌活性下降速率加快，并且差異不顯著（P＞0.05）。

2.3.4干酪4 ℃貯藏期間感官評價

通過外觀、口感、風(fēng)味等方面對農(nóng)家干酪進(jìn)行感官評定，干酪保持了良好的狀態(tài)，見蜘蛛網(wǎng)圖7。獲得的結(jié)論是，隨著貯藏時間的延長，兩組干酪的質(zhì)地慢慢變疏松、易碎，苦味有所增加，光澤度下降，但都在可接受的范圍之內(nèi)。加入干酪乳桿菌KLDS 1.0338的干酪外觀、標(biāo)，所以添加干酪乳桿菌能夠有效抑制農(nóng)家干酪中微生物的生長，在冷藏條件下，可以使農(nóng)家干酪的保質(zhì)期延長一倍。

2.3.2干酪4 ℃貯藏期間pH值的變化

圖5　干酪在4 ℃貯藏時pH值的變化Fig.5 Changes in pH of cheese stored at 4 ℃

由圖5可知，貯藏期間未添加KLDS 1.0338對照組與添加KLDS 1.0338實驗組的pH值均呈逐漸下降的趨勢，初始階段對照組pH值顯著高于實驗組（P＜0.05），但是隨著貯藏時間的延長，到12 d時實驗組與對照組的pH值差異不顯著（P＞0.05）。在4 ℃貯藏條件下，實驗組的pH值變化趨勢與對照組相比下降的更平穩(wěn)，說明產(chǎn)酸速率降低，更有利于貨架期的延長。

圖6　干酪在貯藏過程中抑菌活性的變化Fig.6 Changes in antimicrobial activity during storage of cheese

2.3.3干酪4 ℃貯藏期間抑菌活性的變化質(zhì)地、口感與對照組基本一致，并且實驗組的風(fēng)味比對照組的更加濃厚，后香感更強，可能由于干酪乳桿菌在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的風(fēng)味化合物融合 到了干酪中。因此，干酪乳桿菌做為輔助發(fā)酵劑對于農(nóng)家干酪的感官評定不會產(chǎn)生不良的影響，反而會增強干酪的風(fēng)味效果。

圖7　貯藏期間干酪感官評價Fig.7 Results of sensory evaluation during storage of cheese

3　結(jié) 論

本實驗通過牛津杯法，排除有機酸和過氧化氫的干擾，從實驗室現(xiàn)存的7 種不同的乳酸菌菌種中篩選獲得一株具有較強抑菌活性的KLDS 1.0338菌株，通過表型鑒定、生理生化鑒定以及特異性引物PCR分析確定KLDS 1.0338為干酪乳桿菌。

在4 ℃貯藏過程中，添加干酪乳桿菌KLDS 1.0338的干酪表面光滑、無裂痕，質(zhì)地細(xì)膩，無異味，與對照組相比感官評價無顯著差異。貯藏3 d后對照組的細(xì)菌總數(shù)上升速率明顯高于實驗組，貯藏期間添加干酪乳桿菌的干酪pH值下降更為平緩，隨著貯藏時間的延長抑菌活性顯著高于對照組（P＜0.01），說明干酪乳桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素可以有效控制農(nóng)家干酪中微生物的生長，從而延長干酪的保質(zhì)期。通過觀察農(nóng)家干酪中添加干酪乳桿菌的變化，建立貯藏保鮮的新技術(shù)，以解決運輸和保藏中遇到的困難。

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Screening of Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria and Application in Extending Shelf-Life of Cottage Cheese

YU Wei1， MA Chunli2， SUN Tingting1， LIU Mei3， ZOU Li1，*
（1. College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China； 2. College of Food Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China； 3. Liaoning Huishan Dairy Group Co. Ltd.， Shenyang 110164， China）

The strain KLDS 1.0338 capable of producing a high yield of bacteriocin， an antimicrobial substance effective against Staphylococcus aureus， was screened from 7 strains of lactic acid bacteria preserved in our laboratory by separation and purification. By eliminating the interference of organic acid and hydrogen peroxide and by conducting protease sensitivity tests， we confirmed the antimicrobial role of this bacteriocin. Based on morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis， the strain was identifi ed as Lactobacillus casei ATCC 334. This strain was used to produce cottage cheese and the changes in cheese quality during storage at 4 ℃ were examined. The experimental group obtained from co-fermentation with L. casei was compared with the control group fermented without using L. casei. In the experimental group， the antibacterial activity was significantly enhanced （P ＜ 0.01）， the pH value decreased gradually， the shelf-life of cottage cheese was effectively extended while maintaining the original color， fl avor，texture and other sensory characteristics of products.

bacteriocin； isolation and screening； cottage cheese； shelf-life

TS201.3

A

1002-6630（2015）03-0142-05

10.7506/spkx1002-6630-201503027

2014-05-04

教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃”項目（IRT0959，NEAU）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31101318）

于微（1982—），女，博士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：yuwei_www@163.com

鄒莉（1966—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：13903650896@163.com