張 雷， 李利軍， 白大偉， 程 昊， 李彥青，崔福海， 趙 斌， 胡 延

(廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程系，廣西柳州 545006)

沒食子酸化學(xué)名稱為3,4,5-三羥基苯甲酸(Gallic Acid,GA),是可水解單寧的組成部分，又稱五倍子酸，它不僅有較強(qiáng)的抗氧化作用，還有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒和抗腫瘤作用[1]。目前，有關(guān)沒食子酸的含量測定方法有薄層掃描法[2]、高效液相色譜法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]、流動注射法[5，6]和電化學(xué)方法[7]等。但這些方法存在靈敏度不高，或選擇較差，或操作繁瑣耗時等缺點(diǎn)。

分子印跡技術(shù)是通過模板分子與功能單體之間的共價鍵或非共價鍵作用，在聚合過程中將模板分子固定在交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)上,除去模板分子后留下與模板分子形狀相匹配的孔穴，在合成材料中形成具有高親和力和高選擇性的分子識別位點(diǎn)[8 - 10]。分子印跡聚合物(MIP)膜具有選擇性強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、對環(huán)境的耐受性好和制備簡單、造價低廉等優(yōu)點(diǎn)[11],與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，研制的分子印跡電化學(xué)傳感器不僅選擇性較好,而且靈敏度較高。當(dāng)前有關(guān)沒食子酸的分子印跡電化學(xué)傳感器的研究尚少見報道。本文以沒食子酸為模板分子，采用自由基熱聚合的方式合成MIPs，構(gòu)建了測定沒食子酸的新型分子印跡電化學(xué)傳感器,并對其性能進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660b電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器有限公司)，三電極系統(tǒng)：玻碳電極或修飾電極為工作電極，213型鉑片電極為對電極，232型飽和甘汞電極為參比電極。ZFD-A5040A型恒溫干燥箱(北京宏昌信科技有限公司)；PE-521)型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海越眾儀器設(shè)備有限公司)。

沒食子酸(GA，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);α-甲基丙烯酸(α-MAA)、偶氮二異丁腈(AIBN)(化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，阿拉丁試劑);焦性沒食子酸、水楊酸、對羥基苯甲酸、水楊酸、KCl、K3[Fe(CN)6]、乙腈、甲醇、HAc等均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

六味地黃丸(馬鞍山天?？邓帢I(yè)有限公司)。

1.2 玻碳電極的預(yù)處理

將玻碳電極(GCE，Φ=3 mm)依次用0.3、0.05 μm Al2O3懸濁液在鹿皮上打磨拋光，用水清洗干凈后，將電極依次置于HNO3(1+1)、無水乙醇和二次蒸餾水中各超聲清洗5 min，最后用二次蒸餾水沖洗干凈待用。將預(yù)處理好的GCE置于0.5 mol/L H2SO4中，在-0.6～+0.8 V電位區(qū)間，以50 mV/s的掃描速度掃描20圈，直至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定。

1.3 分子印跡和非印跡修飾電極的制備

取模板分子沒食子酸(0.1 mmol)，功能單體MAA(0.6 mmol)，溶于20 mL乙腈，置于單口燒瓶中，超聲振蕩5 min，靜置2 h，使沒食子酸和MAA充分作用，而后加入3 mmol EGDMA和0.01 g AIBN，超聲混合均勻。將燒瓶連接旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置，于溫度55 ℃下減壓蒸餾-沉淀聚合3 h，然后取3 μL上述溶液均勻滴涂在處理好的GCE表面，置于55 ℃恒溫干燥箱內(nèi)再聚合2 h，電極表面形成了一層均勻透明的聚合物膜。將聚合好的分子印跡電極(MIP/GCE)置于含有甲醇-HAc的溶液中浸泡，以除去印跡分子，再用二次蒸餾水洗去印跡電極表面的甲醇和HAc，將其保存于二次蒸餾水中待用。非印跡電極(NIP/GCE)的制備除不加入模板分子外，其余步驟同上。

圖1 以沒食子酸為模板的分子印跡聚合物膜的制備過程示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物的制備

分子印跡聚合物的制備過程如圖1所示，MAA與沒食子酸在乙腈中以氫鍵(沒食子酸上的羥基與MAA上的羰基間，以及沒食子酸上的羰基與MAA上的羥基均有可能形成氫鍵)等非共價鍵的形式預(yù)先自組排列，然后加入交聯(lián)劑EGDMA交聯(lián)聚合，使其形成空間網(wǎng)狀聚合物，最后在適當(dāng)溶劑的作用下除去沒食子酸，從而在聚合物膜內(nèi)留下與沒食子酸空間大小相匹配并能可逆結(jié)合沒食子酸的“孔穴”。

2.2 分子印跡膜的性質(zhì)

圖2 不同電極在K3[Fe(CN)6]溶液中的循環(huán)伏安圖

圖2為不同電極在K3[Fe(CN)6]溶液中的循環(huán)伏安曲線。將非印跡電極經(jīng)甲醇-HAc洗脫后，于K3[Fe(CN)6] 溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，該電極響應(yīng)很小(圖2曲線d)，結(jié)果表明電極的表面形成了一層較致密的聚合物膜，導(dǎo)致K3[Fe(CN)6]向電極表面的擴(kuò)散比較困難。將印跡電極于甲醇-HAc中浸泡30 min后，K3[Fe(CN)6]在該電極上的循環(huán)伏安曲線的峰電流比在相同條件下處理過的非印跡電極顯著增大(圖2曲線b)，但比裸電極有所下降(圖2曲線a)，說明印跡分子沒食子酸經(jīng)甲醇-乙酸洗脫后，在印跡膜上形成了匹配的“孔穴”，允許K3[Fe(CN)6] 擴(kuò)散到電極表面，因此電化學(xué)信號增強(qiáng)；但電極表面的大部分還是被印跡聚合膜所覆蓋，所以其峰電流比裸電極小。加入一定濃度的沒食子酸與印跡電極作用后，峰電流有所下降(圖2曲線c)，這是由于印跡電極吸附了沒食子酸，占據(jù)了部分“孔穴”，導(dǎo)致擴(kuò)散到電極表面的K3[Fe(CN)6] 分子減少。

2.3 模板分子洗脫溶劑的選擇

研究了20 mL體積比分別為9∶1、4∶1、3∶2、1∶1的洗脫溶液對模板分子的洗脫效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)甲醇和HAc體積比為9∶1時，模板分子去除困難，這是因?yàn)橄疵撊軇┑臉O性較弱，難以破壞氫鍵，所以模板分子難以去除；當(dāng)甲醇和HAc體積比為3∶2和1∶1時，雖然能迅速的洗脫掉模板分子，但不能維持聚合物膜骨架的穩(wěn)定，這是因?yàn)橄疵撊軇┑臉O性較強(qiáng)，使功能單體與交聯(lián)劑的聚合能力和交聯(lián)程度均有所下降，導(dǎo)致聚合物膜穩(wěn)定性變差；而用體積比為4∶1的甲醇-HAc溶液作為模板洗脫溶劑時，既可迅速去除模板分子，又可保持聚合物膜骨架的穩(wěn)定性。因此選擇20 mL體積比為4∶1的甲醇-HAc溶液作為去除模板的最優(yōu)溶劑。

2.4 模板分子洗脫時間的選擇

用20 mL體積比為4∶1的甲醇-HAc溶液作為洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，洗脫時間與方波伏安氧化峰電流關(guān)系的研究結(jié)果表明(圖3)，隨著洗脫時間增加，印跡膜電極在K3[Fe(CN)6]溶液中的峰電流值逐漸增大，當(dāng)洗脫時間達(dá)到30 min時，電極在K3[Fe(CN)6]溶液中的峰電流值變化趨于穩(wěn)定，所以本實(shí)驗(yàn)選擇30 min作為最佳洗脫時間。

2.5 吸附時間的影響

在含有一定濃度的模板分子溶液中，通過對吸附時間與方波伏安氧化峰電流關(guān)系的研究(圖4)，發(fā)現(xiàn)隨著吸附時間的增加，印跡電極在K3[Fe(CN)6]溶液中的峰電流逐漸減小，但是當(dāng)吸附時間大于12 min后峰電流基本不再減小，說明吸附趨于飽和。本實(shí)驗(yàn)選擇吸附時間為12 min。

圖3 不同洗脫時間的印跡電極在K3[Fe(CN)6]溶液中的方波伏安圖

圖4 不同吸附時間的印跡電極在K3[Fe(CN)6]溶液中的方波伏安圖

2.6 不同濃度的沒食子酸與K3[Fe(CN)6] 峰電流的關(guān)系

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，將洗脫完全后的印跡電極在不同濃度的沒食子酸溶液中吸附相同的時間，記錄K3[Fe(CN)6] 氧化峰電流的變化，結(jié)果表明隨著沒食子酸濃度的增加，K3[Fe(CN)6]氧化峰電流逐漸降低?？紤]到電極經(jīng)過多次處理后電極表面電化學(xué)活性存在一定的差異，所以實(shí)驗(yàn)用氧化峰電流差△I來描述峰電流的變化,△I為未加入沒食子酸時與加入某一濃度的沒食子酸時K3[Fe(CN)6]溶液的氧化峰電流之差[12]。結(jié)果表明，△I與沒食子酸的濃度在4.69×10-6～2.14×10-5mol/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：△I(μA)=0.5047c(μmol/L)-0.8625(R2=0.9962),檢出限(S/N=3)為6.41×10-7mol/L。

2.7 傳感器的選擇性、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性

在選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，固定沒食子酸的濃度為1.0×10-5mol/L，考察了其它類似物對沒食子酸印跡膜的影響。結(jié)果表明，允許誤差范圍≤±5%，3倍的焦性沒食子酸，10倍的水楊酸、對羥基苯甲酸、苯甲酸對沒食子酸的測定均不產(chǎn)生干擾，說明該傳感器對沒食子酸具有較好的選擇識別性。

同一支印跡電極對1.0×10-5mol/L的沒食子酸溶液平行測定5次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.96%，表明該印跡電極有較好的重現(xiàn)性。同一支印跡電極于4 ℃放置冰箱一周后，對沒食子酸的響應(yīng)值能達(dá)到初始值的90%以上，表明該印跡電極有較好的穩(wěn)定性。

2.8 樣品分析及回收率

取六味地黃丸顆粒，研磨粉碎后，加入一定量的乙醇超聲溶解，離心后取上清液轉(zhuǎn)至100 mL容量瓶中定容，加標(biāo)回收平行測定上述溶液三次，結(jié)果見表1。

表1 樣品分析及回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

結(jié)果表明，該方法所制備的分子印跡電化學(xué)傳感器對沒食子酸的檢測具有較好的重現(xiàn)性和較高的準(zhǔn)確度，用于六味地黃丸樣品的檢測，回收率在95.1%～104.8%之間，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%。

3 結(jié)論

以沒食子酸為模板分子，采用蒸餾-沉淀自由基熱聚合法，縮短了聚合所需的時間，成功研制了沒食子酸分子印跡電化學(xué)傳感器。利用方波伏安法，以鐵氰化鉀為電活性探針，建立了間接測定沒食子酸的電化學(xué)分析新方法，該方法具有選擇性高、檢出限低、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，用于六味地黃丸中沒食子酸含量的檢測，結(jié)果滿意。