吳光斌， 胡 陽(yáng)， 倪 輝， 蔡慧農(nóng)

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門 361021)

苯二胺類染發(fā)劑具有染色效果好、色調(diào)變化寬、維持時(shí)間長(zhǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的染發(fā)劑，但該類染發(fā)劑中所用到的一些染料中間體如p-苯二胺、p-氨基苯酚等具有致敏性和致突變性[1，2]，特別是苯二胺的一些衍生物，可經(jīng)皮膚吸收，引起皮疹和使肝臟受損害[3，4]。目前染發(fā)劑的檢測(cè)方法主要包括薄層色譜[5]、高效液相色譜(HPLC)[6]、液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)[7]、氣相色譜(GC)[8]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)[9]、離子色譜法[10]、毛細(xì)管電泳[11]等。由于苯二胺及其衍生物具有強(qiáng)極性、低揮發(fā)性及不穩(wěn)定性的特點(diǎn)，且一種染發(fā)劑中往往同時(shí)添加了多種苯二胺衍生物，因此，HPLC法是最理想的檢測(cè)方法。雖然已經(jīng)有一些研究運(yùn)用HPLC對(duì)單種或幾種苯二胺類染料進(jìn)行了測(cè)定，但對(duì)染發(fā)劑中多種p-苯二胺N位衍生物的分析研究較少。

本實(shí)驗(yàn)用HPLC-紫外(UV)檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定染發(fā)劑中m-苯二胺、p-苯二胺鹽酸鹽、p-氨基苯酚、o-苯二胺、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、2-硝基-p-苯二胺、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、N,N-二甲基-p-苯二胺硫酸鹽、N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽、N-苯基-p-苯二胺鹽酸鹽10種苯二胺衍生物，方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可基本滿足實(shí)際樣品分析要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 1525高效液相色譜儀(美國(guó)，Waters)，配紫外(UV)檢測(cè)器；pH211型pH計(jì)(意大利,Hanna)；KQ-250E型超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司)；EL104型電子天平(瑞士,Mettler-Toledo)；5415D型離心機(jī)(德國(guó),Eppendorf )。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥98%)：m-苯二胺、p-苯二胺鹽酸鹽、p-氨基苯酚、o-苯二胺、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、2-硝基-p-苯二胺、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、N,N-二甲基-p-苯二胺硫酸鹽、N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽、N-苯基-p-苯二胺鹽酸鹽，均購(gòu)自日本東京化成公司。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取62.5 mg上述10種標(biāo)準(zhǔn)品，各加入25 mg Na2SO3，用50%乙醇水溶液定容至25 mL容量瓶中，混勻，濃度為2.5 g/L，-18 ℃保存一周。混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取適量的各單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50%乙醇水溶液稀釋成濃度為0.1、1、5、50、100、200、400 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。25 mmol/L磷酸鹽緩沖液體系：稱取Na2HPO40.958 g、KH2PO43.06 g、辛烷磺酸鈉1.0 g溶于約900 mL超純水中，H3PO4調(diào)節(jié)pH值至6.0，定容至1 000 mL；1%Na2SO3溶液。乙腈(美國(guó)天地公司)、辛烷磺酸鈉(美國(guó)Sigma公司)均為色譜純；Na2SO3、Na2HPO4、KH2PO4、乙醇等均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g染發(fā)劑樣品(精確至0.000 1 g)，置于50 mL容量瓶中，加入約10 mL 50%乙醇水溶液，使樣品完全溶解，然后加入1 mL 1%的Na2SO3溶液，用50%乙醇水溶液定容。渦旋混合后超聲提取15 min，轉(zhuǎn)移至離心管以4 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜后，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Discovery RP-Amide C16柱(250×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Supelco公司)；流動(dòng)相：A相為25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.0,含0.1 %的辛烷磺酸鈉)，B相為乙腈；梯度洗脫：0～8 min，5%～40%B；8～15 min，40%～90%B；15～22 min，90%～5%B；22～25 min，5%B。流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：250、280 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

本方法采用50%乙醇水溶液超聲波提取，由于苯二胺衍生物中間體極易氧化變質(zhì)，因此在提取過(guò)程中加入還原劑1 mL 1%Na2SO3溶液以提高苯二胺衍生物的回收率。樣品無(wú)需凈化，即采用提取液離心去沉淀并過(guò)濾后直接進(jìn)樣，方法簡(jiǎn)便、快速。

2.2 液相色譜條件的選擇

2.2.1色譜柱的選擇實(shí)驗(yàn)比較了RP Amide C16柱(美國(guó)Supelco公司)和ZORBAX Extend C18柱(美國(guó)Agilent公司)的分離效果，結(jié)果顯示RP Amide C16柱對(duì)胺類物質(zhì)有良好的保留能力和分離度。因此實(shí)驗(yàn)選用RP Amide C16柱。

2.2.2流動(dòng)相體系的選擇實(shí)驗(yàn)研究了不同溶劑、pH值及離子對(duì)試劑對(duì)分離效果的影響。考察了水-甲醇、水-乙腈、甲醇-磷酸鹽緩沖鹽(用NaOH調(diào)節(jié)pH值6.0、6.5、7.0)、乙腈-磷酸鹽緩沖液(用NaOH調(diào)節(jié)pH值6.0、6.5、7.0)、乙腈-磷酸鹽緩沖液(用NaOH調(diào)節(jié)pH值6.0、6.5、7.0，含0.1%的辛烷磺酸鈉)5種流動(dòng)相體系對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果表明：采用乙腈作為有機(jī)相較甲醇能獲得較好的峰形及保留；采用pH值為6.0的磷酸鹽緩沖液做流動(dòng)相時(shí)，各目標(biāo)物的分離效果最好；采用辛烷磺酸鈉的離子對(duì)試劑可以明顯改善保留和峰形。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈-磷酸鹽緩沖液(用NaOH調(diào)節(jié)pH值6.0，含0.1%的辛烷磺酸鈉)作為最佳流動(dòng)相。 等度洗脫難以將10種目標(biāo)物與樣品中的其它染料成分有效分離。因此采用梯度洗脫，優(yōu)化的流動(dòng)相梯度洗脫如1.3節(jié)所述。

2.2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇對(duì)10種目標(biāo)物進(jìn)行紫外區(qū)光譜掃描，除N-苯基-p-苯二胺鹽酸鹽在280 nm有特征吸收外，其它成分在250 nm左右區(qū)域都有吸收峰，因此實(shí)驗(yàn)選用250 nm和280 nm作為定量檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.4柱溫的選擇實(shí)驗(yàn)選擇25 ℃作為色譜柱溫度，保證了保留時(shí)間的穩(wěn)定性，同時(shí)也避免溫度過(guò)高引起染料成分的變化。

在上述優(yōu)化的液相色譜條件下，10種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品的典型色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 10種苯二胺衍生物標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同質(zhì)量濃度的10種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，10種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度在0.1～400 mg/L范圍內(nèi)與響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9992～0.9999。分別以信噪比(S/N)=3和S/N=10計(jì)算方法的檢出限和定量限(表1)。完全滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[12]對(duì)染發(fā)劑的檢測(cè)要求。

2.4 回收率與精密度

選擇染發(fā)劑樣品(10種苯二胺衍生物均未檢出)，在所確定的定量限基礎(chǔ)上添加3個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定6次，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明，10種苯二胺衍生物的加標(biāo)回收率為86%～115%，RSD均小于10%，說(shuō)明該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度好、精密度均較好。

表1 10種苯二胺衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用本方法測(cè)定了5種市售染發(fā)劑中10種苯二胺衍生物的含量。結(jié)果表明所測(cè)染發(fā)劑樣品中各種苯二胺衍生物成分的含量符合我國(guó)《化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，未發(fā)現(xiàn)含量超標(biāo)情況。

3 結(jié)論

建立了染發(fā)劑中10種苯二胺衍生物的高效液相色譜檢測(cè)方法，該方法樣品前處理操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、精密度好、回收率高、為染發(fā)劑的監(jiān)督檢測(cè)提供了良好的技術(shù)支持，也是《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)中檢測(cè)方法的良好補(bǔ)充。

致謝：歐光南老師對(duì)本論文及實(shí)驗(yàn)給予了大力幫助，在此表示感謝！