雷琎等

摘要：Escherichia coli Rosetta菌株是基因克隆表達的重要宿主菌，為了探索裂解E.coli Rosetta菌體的新方法，從污水中分離到1株能裂解E.coli Rosetta菌株的噬菌體，命名為ETP-1，并研究其生物學(xué)特性和裂解效率。結(jié)果表明，EPT-1在雙層平板上形成直徑為1～3 mm的噬菌斑；噬菌斑透明，周圍有暈環(huán)；該噬菌體的潛伏期為20min，裂解期為70 min，在55 ℃以上以及pH值大于11時，噬菌體失去活性。在6 h內(nèi)，噬菌體可裂解73%的E.coli Rosetta菌體，ETP-1裂解其宿主細胞為E.coli Rosetta菌株菌體的破碎提供了新的方法。

關(guān)鍵詞：細胞破碎方法；E.coli Rosetta；噬菌體；裂解效率

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0061-03

收稿日期：2014-09-16

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31160035、31260034）。

作者簡介：雷琎（1989—），男，云南昆明人，碩士研究生，主要從事噬菌體及其蛋白研究。E-mail：leijin1989@hotmail.com。

通信作者：林連兵，碩士，教授，主要從事高溫噬菌體研究。E-mail：570782220@qq.com大腸桿菌系統(tǒng)由于其遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面已充分被人們了解而成為表達多種異源蛋白質(zhì)的首選系統(tǒng)[1]。迄今為止，由大腸桿菌改造而來的基因工程菌已達近百種之多，常用的就有50種左右[2]，如E.coli BL21、E.coli Rosetta、E.coli JM109、E.coli JM110等。常見的大腸桿菌噬菌體也有很多種，如烈性噬菌體中的T4噬菌體、T1噬菌體，溫和噬菌體中的λ噬菌體[3]。T4噬菌體常用于噬菌體展示，λ噬菌體常作為克隆表達的載體。實驗室中常用E.coli Rosetta作為克隆表達菌株，E.coli Rosetta在E.coli BL21基礎(chǔ)上，補充了大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子對應(yīng)的tRNA，以提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。克隆表達的一般步驟是誘導(dǎo)表達后，直接使用超聲破碎細胞。超聲破碎是一種相對溫和的細胞破碎方法，但是超聲破碎時會產(chǎn)生一定的熱量，對于一些結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的目的蛋白，其結(jié)構(gòu)依然會被破壞。本研究以E.coli Rosetta為宿主菌，分離E.coli Rosetta的噬菌體，對其進行感染、裂解，對其生物學(xué)特征、裂解效果等進行研究，探索使用噬菌體替代超聲破碎細胞的可行性。

1材料與方法

1.1菌種及噬菌體來源

E.coli Rosetta菌株。

1.2主要試劑和儀器

LB培養(yǎng)基、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱。

1.3ETP-1的分離

采集生活污水10 mL經(jīng)5 000 g、15 min離心去除雜質(zhì)，再經(jīng)0.22 μm的濾膜濾除細菌，收取濾液，吸取濾液5 mL與過夜培養(yǎng)的E.coli Rosetta 培養(yǎng)液5 mL混勻，于37 ℃、12 h振蕩培養(yǎng)。

根據(jù)文獻[4]的方法，采用雙層平板法檢測和篩選噬菌體。將上述培養(yǎng)液離心并通過0.22 μm濾膜過濾，取200 μL濾液和200 μL 處于對數(shù)期的E.coli Rosetta 菌液混合，靜置15 min后，將其加入裝有4 mL 0.9%瓊脂的預(yù)熱LB半固體培養(yǎng)基的離心管中，混勻后平鋪至LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察噬菌體的生長情況。若有噬菌斑，挑取單個形態(tài)均一噬菌斑。將噬菌斑置于4 mL無菌水的離心管中，37 ℃溫浴0.5 h，取100 μL上述噬菌體懸液和宿主做雙層平板。重復(fù)4～5次可得到純噬菌體。

1.4ETP-1的電鏡觀察

取出單個噬菌斑于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，用10%的PEG8000在4 ℃下過夜沉淀后，將沉淀溶于SM緩沖液中，再加入CsCl，使其ρ=1.5 g/mL。以36 000 r/min超速離心18 h，抽取噬菌體條帶，通過負染后觀察。

1.5噬菌體一步生長曲線繪制

按照文獻[5]的方法。取一定量的新鮮噬菌體培養(yǎng)液 1 mL （病毒滴度≈107 PFU/mL）與處于對數(shù)生長期的E.coli Rosetta 10 mL混合，使得感染復(fù)數(shù)MOI=0.01，37 ℃溫育 10 min。13 000 g離心2 min，棄上清，用30 μL的LB液體培養(yǎng)基洗滌3次，最后用30 μL LB液體培養(yǎng)基懸浮宿主細胞。取60 μL上述細胞到5 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)100 min，同時開始計時，每隔10 min取100 μL培養(yǎng)液測定噬菌體的滴度。以感染時間為橫坐標、滴度的對數(shù)為縱坐標，繪制一步生長曲線，估算出噬菌體的潛伏期、暴發(fā)期。

1.6溫度對噬菌體活性的影響

按照文獻[5]的方法，將噬菌體懸液（將LB液體培養(yǎng)基099 mL和0.01 mL滴度為1×107 PFU/mL的噬菌體懸液混合），分別置于15、25、35、45、55、60 ℃處理1 h，每隔20 min取樣，用雙層平板測定滴度。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7pH值對噬菌體活性的影響

按照文獻[5]的方法，將pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11的LB液體培養(yǎng)基0.99 mL和0.01 mL滴度為1×107 PFU/mL的噬菌體懸液混合，室溫靜置1 h，分別用雙層平板測定噬菌體滴度。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.8ETP-1感染E.coli Rosetta對其生長的影響

分別設(shè)立試驗組和對照組，測定Rosetta的生長曲線，當培養(yǎng)至對數(shù)期時（D600 nm≈0.6）加入一定效價的噬菌體懸液體，使MOI=0.01，培養(yǎng)20 h，每隔30 min分別測定D600 nm的數(shù)值。以橫坐標為時間、縱坐標為D值繪制一條試驗組與對照組的Rosetta生長曲線。

1.9ETP-1對E.coli Rosetta裂解效果

準備3組150 mL的液體培養(yǎng)基在恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)E.coli Rosetta，至對數(shù)期（D600 nm≈0.6）。分別設(shè)立試驗組、對照組和空白組，向試驗組中加入一定效價的噬菌體，使MOI=0.01，空白組加入等量無菌水，然后分別繼續(xù)培養(yǎng)6 h。對照組以5 000 g離心，然后將菌體溶于5 mL的LB培養(yǎng)基，使用超聲破碎法破碎細胞。試驗組和空白組先以5 000 g離心，然后取上清，再濃縮至5 mL。分別測定3組的蛋白含量，同時進行SDS-PAGE。

2結(jié)果與分析

2.1E.coli Rosetta噬菌體的噬菌斑形態(tài)和電鏡圖

通過雙層平板法，分離E.coli Rosetta噬菌體，命名為 ETP-1。EPT-1在雙層平板上形成直徑為1～3 mm的噬菌斑，噬菌斑透明（圖1）。

從電鏡圖（圖2）中可看出，ETP-1有1個正多面體對稱的頭部，直徑約為50 nm，尾長約100 nm，尾部帶有基盤。根據(jù)其形態(tài)特征，ETP-1屬于有尾噬菌體目長尾噬菌體科。

2.2E.coli Rosetta的噬菌體一步生長曲線

如E.coli Rosetta噬菌體的一步生長曲線（圖3）所示，E.coli Rosetta噬菌體從吸附吸附、侵染、復(fù)制到病毒顆粒全部釋放總共持續(xù)約110 min。在這個過程中，E.coli Rosetta噬菌體的潛伏期約是20 min，暴發(fā)期約70 min。

2.3溫度對噬菌體活性的影響

溫度對噬菌體活性的影響分析結(jié)果（圖4）表明，ETP-1在25 ℃最穩(wěn)定，隨著溫度的升高，ETP-1的存活率降低，在45 ℃和55 ℃經(jīng)過1 h處理后，噬菌體的滴度降低了50%和80%，在60 ℃處理1 h后，噬菌體基本完全喪失感染能力。

2.4pH值對噬菌體活性的影響

pH值對噬菌體活性影響分析結(jié)果（圖5）表明，在pH值4～8內(nèi)，ETP-1依然保持著90%以上的滴度；當pH值>8后，噬菌體的滴度隨著pH值的增大明顯降低；當pH值=11時，ETP-1僅剩下20%的滴度；噬菌體對于酸性環(huán)境有較好的耐受能力，當pH值=3時，ETP-1仍保持著60%以上的滴度。

2.5ETP-1感染對E.coli Rosetta生長的影響

通過上述試驗可知，在3.5 h加入噬菌體ETP-1后（如圖6箭頭所示），試驗組中的E.coli Rosetta的生長受到抑制，其吸光度下降，對照組中的E.coli Rosetta的生長正常。

2.6ETP-1裂解E.coli Rosetta的效果評價

2.6.1蛋白質(zhì)含量測定通過測定3管液體的蛋白質(zhì)含量可知，對照組（超聲破碎）蛋白質(zhì)含量為2.30 mg/mL，試驗組（噬菌體破碎）蛋白質(zhì)含量為1.69 mg/mL，空白組蛋白質(zhì)含量為0.16 mg/mL。如果通過超聲破碎的細胞破碎率為100%，以蛋白質(zhì)含量來衡量破碎率，則通過噬菌體破碎的效率達73%（表1）。

表1細胞裂解液的蛋白質(zhì)含量

破碎方法蛋白質(zhì)含量

（mg/mL）破碎率

（%）對照組（超聲破碎）2.30100試驗組（噬菌體破碎）1.6973

2.6.2蛋白質(zhì)電泳結(jié)果通過蛋白質(zhì)電泳（圖7）可知，泳道1為對照組（超聲破碎），其細胞完全破碎。泳道2為試驗組（噬菌體破碎），泳道1和泳道2的條帶基本一致，表明細胞基本裂解，而部分條帶的丟失可能是細胞中部分細胞器沒有完全裂解造成的。泳道3為空白組，E.coli Rosetta自然情況下也會有少數(shù)細胞自行裂解或向外分泌了少量蛋白質(zhì)。

3討論

噬菌體廣泛存在于細菌存在的環(huán)境中，人們對噬菌體的研究取得了可喜的進展。目前對于噬菌體研究一般集中于噬菌體治療、環(huán)境噬菌體上。如Cappaeelu等篩選出可以對抗耐藥性金黃色葡萄球菌，并通過此噬菌體來控制金黃色葡萄球菌的感染，取得了良好的臨床效果[6]。又如洪偉等從云南騰沖熱泉中分離出棲熱菌的噬菌體TSP-10，并對其性質(zhì)進行了研究[7]。

對于分子克隆上，噬菌體研究常見于噬菌體展示技術(shù)，如Ellis等指出利用噬菌體展示多肽庫可以篩選和確定線蟲疫苗的抗原，這是疫苗抗原鑒定的一種新方法[8]。而王曉娜等通過噬菌體展示技術(shù)從抗體庫中篩選出分枝桿菌Acr蛋白，并制備出了Acr蛋白的抗體[9]。但關(guān)于基因工程菌株的噬菌體報道比較少見，僅見黎庶等報道分離出1株基因工程菌株E.coli BL21的噬菌體EECP，并對其性質(zhì)和防止流入發(fā)酵過程做了相關(guān)研究[10]。

烈性噬菌體可以高效裂解細菌，其感染效率很高，一般只需要重復(fù)4次感染周期，1個噬菌體便可殺死數(shù)十億個細菌細胞。鑒于噬菌體有如此強的裂解效率，因此噬菌體可以作為潛在的替代超聲破碎基因工程菌的工具。噬菌體在裂解細菌細胞時，裂解溫和，不會因為物理作用導(dǎo)致基因工程菌表達產(chǎn)物的物理損壞。

在溫度耐受方面，ETP-1在高于55 ℃基本失去感染活性；在pH值耐受方面，ETP-1在pH值超過11后，基本失去活性，而在pH值=3時，仍然有活性，說明ETP-1更能耐受酸性環(huán)境。黎庶分離出的BL21噬菌體對高溫耐受能力好，90 ℃時仍具有活性，在pH耐受能力上，表現(xiàn)為耐堿不耐酸，pH值為3時其噬菌體活性基本喪失[10]，這與本試驗室分離的噬菌體在酸堿耐受力上正好相反。

關(guān)于噬菌體對細胞裂解效率的文獻報道較少，本研究通過收集裂解后的總蛋白液的蛋白量來定義噬菌體破碎效率，可知ETP-1是一種較高裂解效率的噬菌體，在6 h內(nèi)噬菌體的裂解效率達到了73%；進一步試驗結(jié)果表明，其裂解率在12 h可達到95%以上。鑒于噬菌體ETP-1的培養(yǎng)和裂解不需要專門的設(shè)備，如果需要去除裂解液中的噬菌體，可以將裂解液通過簡單的超濾加以過濾收集，噬菌體的滅活可以通過50 ℃的加熱來實現(xiàn)，可見利用ETP-1裂解E.coli Rosetta菌體不失為一種簡單可行菌體破裂的方法。

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